劉湘紅,劉遠(yuǎn)超,韓曉萍,王小鶯
(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江西南昌330045)
鳳尾草(Pteris multifida Poir) 屬于鳳尾蕨科、鳳尾蕨屬,別名雞爪草、井欄草、小葉鳳尾草,多年生草本,生長(zhǎng)于半陰濕的巖石及墻角石隙中。鳳尾蕨全草都可供藥用,主要成分含黃酮類(lèi)、多元酸以及對(duì)映貝殼杉烷型二萜[1]等生理活性物質(zhì),具有清熱利濕、抗菌消炎、消腫止痛等功效,多用于治痢疾和止瀉[2]。民間及臨床用全草治療痢疾、外傷出血、燙傷、燒傷以及扁桃體炎、肝炎等,其根莖還可用于治療糖尿病、抗腫瘤[2]。目前,鳳尾草的抗菌作用雖有文獻(xiàn)記載,但國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道還是較少。鳳尾草功能成分提取近年來(lái)逐步有些報(bào)道,但多數(shù)用水和乙醇提取[1,3]。此外,還有研究用甲醇法[4]、堿液法[5]、色譜分離等提取功能成分。
本研究以鳳尾草為原料,以乙醇和丙酮為溶劑提取及蒸餾水煎煮,比較提取的功能成分抗菌效果,旨在探索較好的提取方法,為鳳尾草藥效的開(kāi)發(fā)和利用提供新思路。
鳳尾草:全草于2011年6月15日采集于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi),清洗干燥粉碎后備用。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、大腸桿菌(Escherichia coli),由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)教研室分離鑒定并保存。
普通肉湯培養(yǎng)基,肉湯瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌培養(yǎng)。
2.1.1 鳳尾草醇提液的制備 取鳳尾草全草洗凈,60℃干燥,粉碎過(guò)40目篩,精密稱(chēng)取粗粉5g,裝于濾紙包內(nèi),置于索氏提取器中,用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇熱回流提取1 h,溫度控制在60℃[3],料液比1:20的相同條件下浸提3次,每次浸提1h,過(guò)濾合并提取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)濃縮(溫度控制在60℃),即得鳳尾草乙醇提取液,濃度為0.7g生藥/ml。
2.1.2 鳳尾草丙酮提取液的制備按上述方法用60%的丙酮替代60%的乙醇熱回流提取濃縮,即獲得鳳尾草的丙酮提取液,濃度為0.943g生藥/ml。
2.1.3 鳳尾草水煎液的制備精密稱(chēng)取鳳尾草干燥粉末5g,加蒸餾水浸泡20min后,以料水比1:30,水煎3次,每次1h,過(guò)濾,合并水煎液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下蒸發(fā)濃縮獲得濃度為0.442 g生藥/ml的鳳尾草水煎液。
將以上三份提取液分別用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后將濾液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?,使用期限為一周?/p>
將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于普通瓊脂培養(yǎng)基,置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~18h,次日挑選單個(gè)菌落1~2個(gè)接種于2ml普通肉湯培養(yǎng)基中,置于37℃恒溫箱16~18h培養(yǎng)后取出。用平皿法測(cè)定細(xì)菌濃度。臨用前將菌液用肉湯培養(yǎng)基稀釋成菌液濃度為105CFU/ml,備用。
按試管二倍稀釋法測(cè)定MIC值。取滅菌小試管30支,每10支一組分別排列試管架上,并將每組試管按照1至10編號(hào),每種菌都三次重復(fù)。放置37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h后取出觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度為提取液對(duì)該細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)。
本實(shí)驗(yàn)所選用水煎煮和用乙醇、丙酮回流提取所得的提取液,對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌的體外抑菌結(jié)果的MIC見(jiàn)表1。
表1 鳳尾草提取液最低抑菌濃度結(jié)果(mg生藥/ml)
由表1可知,三種提取液對(duì)革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌均有抑制作用,但抑制效果不同。丙酮提取液的抑菌活性最強(qiáng),對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及嗜水氣單胞菌的MIC均為29.48(mg生藥/ml)。其次為乙醇提取液,水煎液效果最差。由此可知,用乙醇和丙酮熱回流提取比傳統(tǒng)的水煎法提取鳳尾草的功能成分抗菌效果更好。
水煎液效果差的原因可能與煎煮湯劑所用水量的多少、火候的大小及時(shí)間的長(zhǎng)短等有關(guān),這些因素會(huì)直接影響藥物有效成分溶出,也可能煎煮對(duì)功能成分的破壞有關(guān),因?yàn)閭鹘y(tǒng)的煎煮法溫度達(dá)到100℃。劉國(guó)凌報(bào)道,溫度對(duì)鳳尾草水溶性黃酮的浸提有顯著的提高,但溫度超過(guò)90℃以后,得率稍有下降,可能會(huì)導(dǎo)致部分黃酮類(lèi)物質(zhì)的分解而使總黃酮得率下降[6]。吳英華報(bào)道,在提取因子中,溫度對(duì)鳳尾草總黃酮提取率影響最大。在試驗(yàn)條件下,隨溫度的升高,鳳尾草總黃酮提取率逐漸增大,但當(dāng)溫度達(dá)到60℃以后,溫度再升高,總黃酮的提取率反而下降[3]。
不同方法提取的功能成分會(huì)有所不同,可能會(huì)對(duì)抗菌效果產(chǎn)生影響。近年來(lái),隨著鳳尾草的深入研究,分離提取得到更多的活性成分。據(jù)報(bào)道,劉清飛首次從鳳尾草根莖中分離提取到多個(gè)化合物,鑒定出其中4個(gè)。除β谷甾醇外,其他3個(gè)為四環(huán)二萜貝殼杉烷(烯)類(lèi)化合物,均為首次從鳳尾草根莖中分離到[1]。秦波等人從鳳尾草的丙酮和20%乙醇提取物中,分離得出一個(gè)倍半萜苷和6個(gè)黃酮類(lèi)化合物,其中有4種黃酮類(lèi)化合物為首次分離得到[7]。
中藥提取物本身有顏色,對(duì)MIC測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷有一定影響。提取方法獲得的藥物是否通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑去除的干凈,可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[1]劉清飛,秦明珠.鳳尾草根莖的化學(xué)成分研究.中草藥[J],2002,33(2):1132-1141.
[2]楊春澎.藥用植物學(xué).[M].1997,上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社.
[3]吳英華,蔡小華,任鳳蓮.鳳尾草中總黃酮的提取工藝研究.光譜實(shí)驗(yàn)室[J],2008,25(2):195-198.
[4]王文蜀,王志騫,周亞偉.鳳尾草化學(xué)成分研究.中藥材[J].2008,31(8):1165-1167.
[5]余有貴,趙良忠,段林東.鳳尾草功能成分提取與抗菌效果研究.中國(guó)飼料[J].2004(023):23-24.
[6]劉國(guó)凌,寧正祥,彭小紅.鳳尾草黃酮類(lèi)化合物的水提工藝條件研究.食品科學(xué)[J].2008,29(8):286-288
[7]QINBo.ZHUDa-Yuan,JIANGShan–Hao,et al,Chemical Constituents of Pterismultifida and Their Inhibito2ry Effectson Growth of Rat Pr ostatic Ep ithelial Cells in vitro[J].Chinese Journal of NaturalMedicines,2006,4(6):431.