翟海華 (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271000)
王 娟 常維山 王君瑋 (中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 青島)
試驗研究
禽源空腸彎曲桿菌的分離與雙重PCR鑒定
翟海華 (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271000)
王 娟 常維山 王君瑋 (中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 青島)
以空腸彎曲桿菌保守基因mapA和hipO基因為靶基因,建立空腸彎曲菌的雙重PCR方法,該方法只對空腸彎曲菌有特異性,對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等則不能擴增出特異性片段。利用該方法對從市場、養(yǎng)殖雞和屠宰場的禽源空腸彎曲菌進行了分離和鑒定,平均分離率為35.8%,PCR鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果相一致,說明建立的雙重PCR鑒定方法具有靈敏、特異的特點,可節(jié)省傳統(tǒng)生化鑒定所耗費的時間,為空腸彎曲菌的檢測提供新方法。
空腸彎曲菌 分離 雙重PCR
食源性致病菌作為一個公共衛(wèi)生問題是影響食品衛(wèi)生安全的主要因素之一,而空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)就是食品衛(wèi)生中一種非常重要的食源性致病菌。它是引起人類細菌性腹瀉的最重要原因之一,在很多動物特別是禽類體內(nèi)屬于正常攜帶細菌,如果屠宰過程中不注意衛(wèi)生操作,或者加工不完全,便能夠通過食物鏈傳遞給人類。可以引起人類發(fā)熱、急性胃腸炎,兒童易發(fā)病,免疫低下者會進一步導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦炎、敗血癥等全身性疾病,最嚴(yán)重的并發(fā)癥是某些血清型的C.jejuni感染會引起周圍神經(jīng)自身免疫性疾病-格林巴利綜合癥(Guillain Barre syndrome, GBS)??漳c彎曲桿菌屬于彎曲桿菌屬,是革蘭氏染色陰性菌;具有多形性,呈弧形、螺旋形、海鷗展翅形或S形;無芽胞;一段或兩端有一根鞭毛,呈螺旋性滾動,陳舊培養(yǎng)基中菌形變球狀,喪失動力;為微需氧菌,在大氣或厭氧的環(huán)境中菌不生長。是人畜共患的致病菌,在畜牧業(yè)上,空腸彎曲桿菌可以引起牛和綿羊流產(chǎn),火雞的肝炎和藍冠病,童子雞和雛雞壞死性肝炎,雛雞、犢牛、仔豬的腹瀉等多種疾病。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,PCR方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種病原微生物的檢測,本研究利用空腸彎曲桿菌的特異性的外膜蛋白A基因(mapA)和馬尿酸基因(hipO)對從市場和屠宰場分離到的空腸彎曲菌進行雙重PCR鑒定,不僅方便快捷,節(jié)省了生化試驗的時間和成本,而且特異性強,可信度高。
1.1 培養(yǎng)基 Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基(北京路橋),空腸彎曲桿菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)以及配套試劑(sigma公司),哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)(OXOID公司)。
1.2 主要試劑及器材 新鮮綿羊血(青島海博生物科技公司),2×Taq PCR Master Mix(Promega公司),DNA marker DL2000(TaKaRa寶生物(大連)有限公司),厭氧培養(yǎng)盒和微需氧產(chǎn)氣袋(日本三菱公司)。
1.3 樣品來源 青島市市場上出售活雞的泄殖腔棉拭子,中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心門診實驗室養(yǎng)殖雞的泄殖腔棉拭子,青島市某禽屠宰場雞盲腸。
1.4 試驗菌株 空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33560,大腸埃希菌ATCC 25922,金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213,阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 51329,鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC(B)50115由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心實驗室提供。
2.1 培養(yǎng)基制備 Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基:稱取12.7g培養(yǎng)基溶于l000ml水中,121℃高壓蒸氣滅菌15min,冷卻至適當(dāng)溫度,無菌分裝至5ml離心管中,4℃保存??漳c彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基:40g培養(yǎng)基溶于lO00ml水中,121℃高壓蒸氣滅菌15min,冷卻到50℃左右時加入5%新鮮綿羊血和空腸彎曲菌瓊脂補劑III(Skirrow),空腸彎曲菌瓊脂補劑III(Skirrow)事先用2ml蒸餾水溶解,無菌倒平皿,4℃保存?zhèn)溆?。哥倫比亞血平板?9g培養(yǎng)基溶于lO00ml水中,121℃高壓蒸氣滅菌15min,冷卻到50℃左右時加入5%新鮮綿羊血,無菌倒平皿,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 細菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集的泄殖腔棉拭子置于滅菌Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基中,低溫運回實驗室,劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基上。采集的盲腸樣包裝好,同樣低溫運回實驗室,用接種環(huán)勾取少量盲腸內(nèi)容物,劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基上。劃好的培養(yǎng)基放入?yún)捬跖囵B(yǎng)盒內(nèi),加上微需氧產(chǎn)氣袋,42℃培養(yǎng)36~48h。選擇可疑菌進行染色鏡檢,并接種于哥倫比亞血平板進行純化,純化培養(yǎng)2~3代后可以進行甘油保存或血清保存。
2.3 PCR鑒定 (1)引物設(shè)計:根據(jù)GenBank上發(fā)表的空腸彎曲桿菌特異性基因mapA,hipO的序列設(shè)計了兩對引物,分別是mapA上游:CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG,mapA下游:GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A,擴增片段長度為589bp;hipO上游:ACT GCA AAA TTA GTG GCG,hipO下游GAG CTT TAG CAA ACC TTC C,擴增片段長度為1028bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(2)模版DNA提?。河媒臃N環(huán)挑取哥倫比亞培養(yǎng)基上的適量菌落于500μL滅菌的超純水中,渦旋混勻,12000rpm/min,離心5min,移去上清;再加入200μL滅菌水,吹打混勻,放入100℃水浴鍋內(nèi)作用10min;取出立即冰浴5~10min,12000rpm/min,離心5~10min,取上清于新的1.5ml離心管中。(3)PCR擴增:PCR反應(yīng)體系(25μL):2×Taq PCR Master Mix12.5μL,DNA模板1.5μL,引物各0.5μL,雙蒸水9μL。循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5min,94℃30s,56℃30s,72℃1min,30個循環(huán)后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖(0.5×TBE)凝膠電泳后,觀察并成像。(4)特異性試驗:提取空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33560與大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株6種細菌DNA,進行雙重PCR方法的特異性考察。
2.1 細菌分離培養(yǎng) 在空腸彎曲桿菌選擇性培養(yǎng)基上可疑菌落呈灰色或棕黃色或淺紅色、圓形,半透明,扁平濕潤有光澤,有呈沿接種線向外擴散的趨勢。染色鏡檢為螺旋形、彎曲桿狀或似飛翔的海鷗形的革蘭氏陰性細菌。
2.2 雙重PCR方法的特異性 電泳結(jié)果表明,該兩對引物僅能對空腸彎曲桿菌擴增出兩個特異片段,大小分別約為1028bp和589bp,與設(shè)計DNA片段大小相符。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌均未有擴增產(chǎn)物(附圖)。表明該方法具有很好的特異性。
2.3 雙重PCR方法的應(yīng)用 利用上述細菌分離方法和雙重PCR方法,對從市售活雞上采集的20份泄殖腔棉拭子,中心養(yǎng)殖雞的30份泄殖腔棉拭子,青島某屠宰場100份盲腸樣進行空腸彎曲桿菌的分離鑒定,其中市售活雞樣品分離到8株空腸彎曲桿菌,分離率為40%,養(yǎng)殖雞樣分離得到13份菌株,分離率為43.3%,屠宰場盲腸樣分離到24株,分離率為24%。
附圖 雙重PCR引物特異性驗證結(jié)果
(1)空腸彎曲桿菌常用的選擇性分離培養(yǎng)基主要有兩大類:一類是含血液的培養(yǎng)基,像Campy-BAP瓊脂、Skirrow瓊脂和Butzler氏瓊脂等;另一類是不含血液的培養(yǎng)基如CCDA、卵黃瓊脂等。這些培養(yǎng)基中的血液、碳粉和鐵鹽可以吸附氧氣和毒性物質(zhì),從而保證空腸彎曲菌具有良好的生長狀態(tài)。我們使用的空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基屬于Skirrow瓊脂,典型菌落灰色或棕黃色或淺紅色、圓形,半透明,扁平濕潤有光澤,比較容易分辨。(2)空腸彎曲桿菌是微需氧菌,微需氧產(chǎn)氣袋可以吸收容器中1/2的O2,使CO2濃度變?yōu)?%~8%,從而制造出微需氧的環(huán)境。使用產(chǎn)氣袋,產(chǎn)生的氣體環(huán)境穩(wěn)定,方便快捷,但是成本較高。也可以在密閉容器內(nèi)充入混合氣體,具體比例為N285%,CO210%,O25%。使用混合氣體成本低,就是操作較復(fù)雜,可以在初次分離培養(yǎng)時用微需氧產(chǎn)氣袋,純化培養(yǎng)時用混合氣體。(3)空腸彎曲桿菌的準(zhǔn)確鑒定可以為它的流行病學(xué)及和危害評估提供重要依據(jù),由于空腸彎曲桿菌培養(yǎng)條件比較苛刻,需要微需氧環(huán)境,而且它具有生化反應(yīng)的惰性,所以其傳統(tǒng)的生化鑒定較為困難。PCR這一分子生物學(xué)手段要比傳統(tǒng)方法快速靈敏,雙重PCR又比傳統(tǒng)PCR方法特異性更強,可靠性更高。
本試驗根據(jù)空腸彎曲桿菌mapA和hip O 基因序列設(shè)計兩對引物,用于空腸彎曲桿菌的檢測,結(jié)果表明該二重PCR方法對空腸彎曲桿菌具有特異性,而對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等其他細菌均不能擴增出特異性片段。這種方法的建立大大節(jié)省了生化試驗所消耗的成本和時間,而且特異性、敏感性高,更加適用于臨床和流行病學(xué)調(diào)查。
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S852.61+2
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1007-1733(2013)11-0001-03
2013–07–24)