趙海陽,林年豐,包海鷹*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長春130118;2.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,吉林長春130026)

黃花草木樨(Melilotus officinalis)又名墨里老篤,金花草,黃甜車軸草,草木樨等,屬于豆科草木樨屬。1年生或2年生草本植物[1],具有適應(yīng)性廣、抗逆性強、耐旱、耐寒、耐脊和耐鹽堿等特性[2]。我國四川及長江流域以南各省區(qū)有野生,東北、華北、西北及西藏各省區(qū)都有栽培,歐洲各國也有栽培。宜種于半干燥、溫濕地區(qū)。為水土保持優(yōu)良草種,并為綠肥且花為一種良好的蜜源[3];花干燥后,可直接拌入煙草內(nèi)作芳香劑。適合在干旱環(huán)境中的沙質(zhì)土壤、沙土和中堿性土壤(pH≤9)中種植,具有從空氣中吸收氮的能力,除滿足自身氮需求外,大部分氮聚集于土壤中。黃花草木樨富含蛋白質(zhì),種植它可以獲得高質(zhì)量的青貯飼料和干草飼料,干燥后加工草粉,可作為精飼料。黃花草木樨中含有豐富的生物活性成分,如含有香豆素類、黃酮類、酚酸類、甾體類、三萜類、糖類、蛋白質(zhì)類等化學(xué)成分[4-5]。黃花草木樨具有止咳平喘,抗炎抗菌,散結(jié)止痛、改變血管通透性、促進血液循環(huán)、芳香化濁、調(diào)節(jié)免疫、截瘧等功效[6-7]。目前,對黃花草木樨利用較多的是從中提取精油、香樹脂、凈油和浸膏等,對于黃花草木樨蛋白質(zhì)的研究還沒有先例,本文利用堿提酸沉法研究黃花草木樨種子蛋白質(zhì)的提取工藝,確定了最佳提取條件,為黃花草木樨的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 主要材料:1999年從俄羅斯西伯利亞地區(qū)引進的俄羅斯原種種植的黃花草木樨。主要試劑:氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、甲基紅、溴甲基酚綠、乙醇、鹽酸。主要儀器:恒溫水浴鍋:HHS4數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市晶玻實驗儀器廠;精密pH計:PHS23C型,上海金鵬分析儀器有限公司;低速臺式冷凍離心機:T.D.L-5000-CR,上海安亭科學(xué)儀器廠;高速臺式冷凍離心機:T.G.L-20000-CR;電熱鼓風(fēng)干燥箱:101A23ET,上海實驗儀器廠有限公司;分析天平:AL204,METTL ER TOL EDO;凱氏定氮儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量測定 利用凱氏定氮法GB/T14489.2-2008,多次測定脫脂后的黃花草木樨種子的蛋白質(zhì)含量,計算相對標準偏差,并求出平均值,方為黃花草木樨種子的蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取工藝 具體操作步驟:脫脂后的黃花草木樨種子,在一定的溫度下,加入一定體積,一定pH值的氫氧化鈉溶液,攪拌提取1 h,用離心機以3 500 r/min離心20 min,去沉淀,取上清液用0.05 mol/L的HCI調(diào)節(jié)pH值至一定值,4 000 r/min離心20 min分離除去上清液,將得到的蛋白質(zhì)沉淀加入4倍的蒸餾水,4 000 r/min離心20 min除去廢水,40℃干燥48 h后得粗蛋白備用[8]。

1.2.3 黃花草木樨種子的預(yù)處理 將黃花草木樨種子過篩,粉碎,后再過篩,然后用石油醚回流脫脂。脫脂干燥后貯存于棕色試劑瓶中備用[9]。

1.2.4 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化 1)堿溶pH值的確定試驗:在堿溶溫度35℃,料液比1∶10(W∶V),攪拌提取l h,酸析pH值為4的條件下,分別取堿溶pH值6.0、8.0、10.0、12.0、14.0,以蛋白質(zhì)提取率為評價指標,考察堿溶pH值對蛋白質(zhì)提取效果的影響。2)酸析pH值的確定試驗:在堿溶溫度為35℃,堿溶pH值為10.0,料液比1∶10(W∶V)的條件下,分別取酸析pH值3.8、4.0、4.2、4.4、4.6,以蛋白質(zhì)提取率為評價指標,考察酸析pH值對蛋白質(zhì)提取效果的影響。3)料液比的確定試驗:在堿溶溫度為35℃,pH值為10.0的堿液中,攪拌提取l h,酸析pH值為4.0的條件下,分別取料液比l∶5、l∶10、1∶15、l∶20、l∶25(W∶V),以蛋白質(zhì)提取率為評價指標,考察料液比對蛋白質(zhì)提取效果的影響。4)提取溫度的確定試驗:在pH值為10.0的堿液中,料液比1∶10(W∶V),提取1 h,酸析pH值為4.0的條件下,分別取提取溫度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃以蛋白質(zhì)提取率為評價指標,考察溫度對蛋白質(zhì)提取效果的影響。5)提取工藝的優(yōu)化試驗:在單因素的基礎(chǔ)之上,確定堿溶pH值、酸析pH值、料液比、提取溫度4因素的因素水平,以蛋白質(zhì)的提取率為評價指標,設(shè)計正交試驗,優(yōu)化黃花草木樨種子蛋白質(zhì)的提取工藝。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)提取率的測定[10]按以下公式計算:蛋白質(zhì)提取率=干燥后得到的蛋白質(zhì)(g)/脫脂草木樨種子粉中總的蛋白質(zhì)(g)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)含量,見表2。

表2 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)的含量%

由表2經(jīng)計算可知,黃花草木樨種子蛋白質(zhì)含量的平均值為51.14%,標準偏差(SD)為0.107 788,相對標準偏差(RSD)為0.2%。重復(fù)性試驗,按擬訂的含量測定方法對同一批樣品進行多次測定計算相對標準偏差,數(shù)值越小所測結(jié)果越準確,由此可知,本試驗結(jié)果符合要求,所測結(jié)果可靠。

2.2 單因素實驗及其分析

2.2.1 堿溶pH值的確定 堿溶pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響,見圖1。

圖1 堿溶pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可知,蛋白質(zhì)的提取率是隨著pH值的升高而升高,但pH值達到12時提取率開始有所下降。因此,選擇堿溶pH值12.0較為合適。

2.2.2 酸析pH值的確定 酸析pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響,見圖2。

由圖2可知,酸析pH值為4.4時,蛋白質(zhì)的提取率最高,高于或者低于4.4,蛋白質(zhì)的提取率都有所下降,可能的原因是黃花草木樨種子蛋白的等電點接近4.4,在酸析PH值為4.4時,得到的蛋白質(zhì)沉淀較多,提取率最高。所以,選擇酸析pH值為4.4。

2.2.3 料液比的確定 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響,見圖3。

圖2 酸析pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知,當(dāng)料液比為1∶15時,蛋白質(zhì)的提取率最高。在料液比由1∶5上升到1∶15時,隨著料液比的增加,蛋白質(zhì)的溶解增加,蛋白質(zhì)的提取率升高。料液比達到1∶15后繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)的提取率降低,可能的原因是料液比過高,導(dǎo)致酸析有困難。選擇料液比為1∶15(m∶v)。

2.2.4 提取溫度的確定 溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響,見圖4。

圖4 溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知,溫度的高低對蛋白質(zhì)的提取率有較大的影響。隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)提取率增大,但溫度過高會引起蛋白質(zhì)變性[11],提取溫度從35～50℃提取率升高趨于平緩,考慮節(jié)約能源和保持蛋白質(zhì)功能特性,選擇提取溫度為35℃。

2.3 正交試驗及分析 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。由表3極差R分析可知影響蛋白質(zhì)提取的各個因素主次關(guān)系為:A(堿溶pH值)＞D(料液比)＞B(酸析pH值)＞C(提取溫度)。由K值大小可知,本試驗確定的最優(yōu)工藝條件為A3D2B3C1,即為堿溶pH值12,酸析pH值4.6,提取溫度30℃,料液比1∶15(m∶v)。

表3 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 最優(yōu)工藝的驗證實驗 按照最優(yōu)工藝條件為堿溶pH值12,酸析pH值4.6,提取溫度30℃,料液比1∶15(M∶V)進行驗證試驗,實測蛋白質(zhì)的提取率為56.94%,大于正交試驗中55.93%最好水平,說明最佳提取方式組合是合理有效的。

3 結(jié)論

本實驗通過利用凱氏定氮法,多次測定黃花草木樨種籽的蛋白質(zhì)含量,計算相對標準偏差,計算平均值得出黃花草木樨種籽蛋白質(zhì)含量為51.14%,可知黃花草木樨種子中蛋白質(zhì)含量較高,具有很大的開發(fā)利用價值。本實驗還利用堿提酸沉法從脫脂的黃花草木樨種子中提取蛋白質(zhì),通過單因素及正交試驗確定蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)工藝為堿溶pH值12,酸析pH值4.6,提取溫度30℃,料液比1∶15(M∶V),在該條件下蛋白質(zhì)的提取率最高,為56.94%。

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