秦 虹，梁 琪，張衛(wèi)兵，張 炎，米 蘭

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州730070）

酸奶因其豐富的營養(yǎng)價值、良好的保健功能以及特殊的口感，越來越受到廣大消費者的青睞，但其品質(zhì)受發(fā)酵劑、發(fā)酵條件等因素的影響[1]。若發(fā)酵劑產(chǎn)酸過快，會使酸奶質(zhì)地粗糙、黏度降低并析出大量的乳清，且在貯藏過程中活菌數(shù)下降、后酸化增強，從而影響酸奶的貨架期；若發(fā)酵劑產(chǎn)酸過慢，會使酸奶的發(fā)酵時間延長，產(chǎn)酸不足，導(dǎo)致酸奶的品質(zhì)變差[2-3]。而發(fā)酵條件決定了發(fā)酵劑的產(chǎn)酸速率、凝乳時間、酸奶的組織狀態(tài)及風(fēng)味的形成等[1，4]。商業(yè)上常用的發(fā)酵劑一般由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌組合而成，在酸奶發(fā)酵過程中它們的相互關(guān)系會表現(xiàn)為拮抗作用和協(xié)同作用[5]。對菌株進行組合發(fā)酵主要是利用菌株間的協(xié)同作用，使其代謝產(chǎn)物相互利用，促進生長，提高產(chǎn)酸速率，增強酸化能力，減弱后酸化能力，促進風(fēng)味物質(zhì)和更多胞外多糖的產(chǎn)生等，使各菌株的優(yōu)勢在產(chǎn)品中一起表現(xiàn)出來[6]。發(fā)酵條件會直接影響發(fā)酵成品酸奶的品質(zhì)，這些發(fā)酵條件主要有發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑的接種量、球桿菌的復(fù)配比例和蔗糖的添加量[7]。發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑的接種量和復(fù)配比例對菌體的酸化能力、后酸化能力及胞外多糖的產(chǎn)生等有影響，從而對產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響；蔗糖添加量會影響產(chǎn)品的風(fēng)味[8]。因此，用從合作藏區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離篩選并經(jīng)鑒定的嗜熱鏈球菌Q4和保加利亞乳桿菌G4混菌發(fā)酵酸奶，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，可以為菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為自主知識產(chǎn)權(quán)的酸奶發(fā)酵劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

洪澤縣境內(nèi)的縣鄉(xiāng)河道已進行了多輪治理，但以往河道整治主要是清淤。由于上游泥土的帶入、水體對河床的淘刷，局部河堤、河坡墾種、傾倒垃圾現(xiàn)象的存在，加速了河道的淤積速度，先期疏浚河道又有回淤現(xiàn)象，因此，仍不同程度存在引排不暢、水體交換緩慢、灌排效益下降等問題。

也許是動作太快，等這一切結(jié)束時，周教授幾個還張著大嘴愣怔著。只有可蔓不驚不慌，正像一個長官似地在那教訓(xùn)一個長著娃娃臉的八路軍?？陕闹尥薇拿弊诱f，是不是新兵蛋子嘛，怎么連駁殼槍都不會打嘛，要平端著打知道不？

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌Q4（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌G4（Lactobacillus bulgaricus） 均由甘肅省功能乳品工程實驗室保藏，分離自合作藏區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中；脫脂乳 黑龍江完達山乳業(yè)。

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠；PB-203電子天平 Mettler-Toledo公司；pHS-25數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器廠；LVDV-1旋轉(zhuǎn)式數(shù)顯粘度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

表1 發(fā)酵乳感官評價表Tabel 1 The score table for sensory evaluation of fermented milk

1.2 實驗方法

1.2.1 指標(biāo)的測定

1.2.1.4 活菌數(shù)的測定 將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24h后，將樣品放置至室溫，吸取1mL進行梯度稀釋，選取合適的梯度稀釋液涂布于MRS的固體培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)2d，進行菌落計數(shù)[10]。

1.2.2.4 最佳菌種復(fù)配比例的確定 活化好的菌株按1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2的（球∶桿）比例，3%的接種量接種于含6%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置于37℃培養(yǎng)，記錄凝乳時間，測定酸度、黏度和活菌數(shù)并進行感官評價。

寶寶的性格是通過什么渠道形成的呢？性格是一個人對客觀現(xiàn)實的穩(wěn)固態(tài)度和慣常的行為方式，是人與人、人與環(huán)境相互作用的結(jié)果。雖然先天氣質(zhì)對人的性格有一定的影響，但是性格主要是在后天形成的。

1.2.1.3 黏度的測定 將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24h后，用LVDV-1型黏度計在4℃測定其黏度，單位為Pa·s[9]。

通過以下例句，學(xué)生可歸納出when，where和why以及“介詞+which”如何實現(xiàn)與先行詞的照應(yīng)。

1.2.1.1 凝乳時間 將活化好的菌株按一定的比例接種到12%滅菌脫脂乳中，在適當(dāng)?shù)臏囟认掳l(fā)酵至凝乳，記錄凝乳時間。

1.2.1.5 感官評價 將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24h后，由7個感官評價專家對樣品的色澤和滋味、組織狀態(tài)等指標(biāo)進行綜合評價[11-13]。

1.2.2.1 最佳發(fā)酵溫度的確定 活化好的菌株按1∶1（球∶桿）的比例，3%接種量接種于含6%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置于31、34、37、40、43℃發(fā)酵，記錄凝乳時間，測定酸度、黏度和活菌數(shù)并進行感官評價。

1.2.2 單因素實驗

風(fēng)險匹配制度是指商業(yè)銀行只能向客戶銷售風(fēng)險評級等于或低于其風(fēng)險承受能力評級的理財產(chǎn)品。2011年頒布的《商業(yè)銀行理財產(chǎn)品銷售管理辦法》（以下簡稱為《辦法》）明確規(guī)定商業(yè)銀行銷售理財產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)遵循風(fēng)險匹配原則，禁止誤導(dǎo)客戶購買與其風(fēng)險承受能力不相符合的理財產(chǎn)品。然而，因為缺乏風(fēng)險匹配制度的具體實施細則，風(fēng)險測評的可操作性差，容易造成商業(yè)銀行對理財產(chǎn)品的風(fēng)險評級和對投資者的風(fēng)險承受能力的評級流于形式，誤導(dǎo)投資者購買高于其風(fēng)險承受能力的理財產(chǎn)品。

2.1.4 最佳復(fù)配比例的確定 在酸奶生產(chǎn)中，通常將球、桿菌復(fù)配發(fā)酵酸奶，桿菌的對產(chǎn)酸起主導(dǎo)作用，而球菌通常具有較強的凝乳作用，但是在發(fā)酵劑中桿菌的比例較大時，發(fā)酵劑的后酸化能力強，對產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響[1]。

1.2.2.2 最佳蔗糖添加量的確定 活化好的菌株按1∶1，3%接種量接種于含 4%、5%、6%、7%、8%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置37℃培養(yǎng)，記錄凝乳時間，測定酸度、黏度和活菌數(shù)并進行感官評價。

1.2.1.2 滴定酸度的測定 根據(jù)GB/T 5413.34-2010方法進行測定。

1.2.3 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化 基于單因素實驗，選取因素與水平，以感官評價評分值為響應(yīng)值，通過Box-Behnken實驗設(shè)計對發(fā)酵條件進行優(yōu)化[14-16]。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計因素水平表Table 2 Experimental level and code of variables chosen of Box-Behnken

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

教師是太陽底下最光輝的職業(yè)，也是最平凡的職業(yè)。“吃也清淡，穿也素雅，心懷淡泊，起始于辛勞，收結(jié)于平淡”，這正是教師的人生寫照。學(xué)生的每一次成長和進步都會給教師帶來巨大的欣慰，驅(qū)散生活中的陰霾，激勵著我們不斷啟程、向前。每位教師都應(yīng)該努力追求成為一名真正的“人師”，做好學(xué)生的引路人，為實現(xiàn)偉大而燦爛的中國夢添磚加瓦。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 最佳發(fā)酵溫度的確定 從表3可知，隨著發(fā)酵溫度的增大，酸奶的凝乳時間縮短，說明溫度越高，產(chǎn)酸速率越大，達到發(fā)酵終點的時間越短[17]；滴定酸度逐漸增大；黏度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，其他溫度下發(fā)酵的酸奶的黏度顯著的高于43℃（p＜0.05），與John A[17]的研究報道相一致?；罹鷶?shù)呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，是因為較低的溫度有利于菌體生長[18]。在不同發(fā)酵溫度條件下，酸奶感官評價評分差異顯著（p＜0.05），40℃發(fā)酵時，酸奶的感官評價評分明顯高于其他實驗組，呈微黃色，組織狀態(tài)細膩光滑，且無乳清析出。因此，40℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 最佳蔗糖添加量的確定 不同的蔗糖添加量可以調(diào)節(jié)酸奶最終的酸甜比，使酸奶的風(fēng)味有所改善。從表4可知，在不同的蔗糖添加量下，凝乳時間、滴定酸度、黏度差異不顯著（p＞0.05），因此，不同的蔗糖添加量對凝乳時間、滴定酸度、黏度沒有影響，這與王攀[8]的研究結(jié)果一致?；罹鷶?shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，5%蔗糖添加量時，活菌數(shù)最高，為9.66lg CFU/mL。5%蔗糖添加量時酸奶中的活菌數(shù)與8%蔗糖添加量時差異顯著（p＜0.05），其他實驗組之間差異都不顯著（p＞0.05）。不同的蔗糖添加量對酸奶的感官評價評分影響顯著，當(dāng)加糖量為5%時，感官評價評分顯著的高于其他實驗組（p＜0.05），酸甜比例適中，風(fēng)味最佳；當(dāng)蔗糖添加量為4%，酸奶酸味較重；當(dāng)蔗糖添加量為6%、7%、8%時，酸奶甜味較重。因此，5%為最佳蔗糖添加量。

表3 發(fā)酵溫度的確定Table 3 Determination of the fermentation temperature

表4 蔗糖添加量的確定Table 4 Determination of the addition of suger

表5 接種量的確定Table 5 Determination of the inoculation rate

表6 菌種復(fù)配比例的優(yōu)化結(jié)果Table 6 Determination of the mixing ratio for strains

2.1.3 最佳接種量的確定 發(fā)酵劑接種量過低，產(chǎn)酸速率較慢，使酸奶的凝乳時間延長，影響產(chǎn)品的最終品質(zhì)；接種量過高，產(chǎn)酸速率加快，使酸奶的凝乳時間縮短，但酸味較重、組織狀態(tài)較差且有大量的乳清析出[19]。從表5可知，隨著接種量的增大凝乳時間縮短，滴定酸度增大，活菌數(shù)增大，且他們差異都顯著（p＜0.05）。黏度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，3%接種量時，黏度達最大，為7.96Pa·s，與4%接種量差異不顯著（p＞0.05），與其他實驗組差異顯著（p＜0.05）。發(fā)酵劑接種量對酸奶的感官評價評分影響顯著（p＜0.05），當(dāng)發(fā)酵劑接種量3%時，酸奶組織狀態(tài)細膩，表面光滑，無乳清析出，且感官評價評分顯著高于其他實驗組（p＜0.05）。因此，3%為最佳發(fā)酵劑接種量。

1.2.2.3 最佳接種量的確定 活化好的菌株按1∶1，1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種于含6%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置于37℃培養(yǎng)，記錄凝乳時間，測定酸度、黏度和活菌數(shù)并進行感官評價。

美團點評 CEO王興曾說過，“按每人一頓飯10元計算，一年在餐飲上的消費至少1萬元。作為一門入口的生意，14億人帶來的就是14萬億元的市場。”

從表6可知，在不同復(fù)配比例的條件下，凝乳時間和活菌數(shù)差異不顯著（p＞0.05）。滴定酸度差異顯著（p＜0.05），隨桿菌比例的增大而增大。這一結(jié)果與Cais-sokolinska D[20]的報道是一致的。復(fù)配比例對酸奶的黏度有一定的影響，隨著嗜熱鏈球菌比例的增大而增大，混合菌中嗜熱鏈球菌體積分數(shù)較高時更利于黏性物質(zhì)的產(chǎn)生[21]。當(dāng)復(fù)配比例為1∶1時，產(chǎn)品組織狀態(tài)良好，口感光滑細膩，酸甜比例適中，風(fēng)味最佳，且感官評價評分顯著的高于其他實驗組（p＜0.05）。因此，1∶1為菌種的最佳復(fù)配比例。

由表6模型回歸結(jié)果可知，在95%的置信區(qū)間下，X 2，X 3，X 4，X 5，X 6的 T統(tǒng)計量所對應(yīng)的 P值均小于0.01，即國內(nèi)市場規(guī)模，年平均匯率，嬰幼兒配方乳粉的進口平均價格，國產(chǎn)產(chǎn)品和進口產(chǎn)品的抽檢合格率都是影響嬰幼兒配方乳粉進口量的顯著因素。根據(jù)回歸結(jié)果可以得出以下方程：

2.2 最佳發(fā)酵條件優(yōu)化

基于單因素實驗結(jié)果，用Box-Benhnken實驗設(shè)計對其進行優(yōu)化，實驗結(jié)果見表7。

表7 Box-Benhnken實驗設(shè)計及及響應(yīng)值結(jié)果Table 7 Test design and results of Box-Benhnken

利用Design Expert 8.0擬合實驗結(jié)果得到回歸方程：

通過分析回歸系數(shù)可知各因素影響感官評價評分的主次順序為：發(fā)酵溫度＞蔗糖添加量＞接種量＞復(fù)配比例。對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表8。從表8可知，發(fā)酵溫度、蔗糖添加量對響應(yīng)值的影響極顯著（p＜0.01），接種量對響應(yīng)值影響顯著（p＜0.05），表明這3個因素對感官評價評分的線性效應(yīng)顯著；所有因素的二次項對響應(yīng)值的曲面效應(yīng)極顯著（p＜0.01）；蔗糖添加量和接種量的交互作用對響應(yīng)值的影響極顯著（p＜0.01），表明各影響因素對感官評價的影響不是簡單的線性關(guān)系。該模型達到極顯著水平（p＜0.001），方程的失擬項不顯著（p=0.2920），模型選擇合適。其校正決定系數(shù)（R2Adj）為0.9566，說明此模型對實驗擬合度較高。

表8 Box-Benhnken實驗方差分析Table 8 Analysis of variance for Box-Benhnken

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖（見圖1～圖6），考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析發(fā)酵溫度、蔗糖添加量、接種量、復(fù)配比例對感官評價評分的影響。從響應(yīng)面的最高點可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，即為響應(yīng)面的最高點。

圖1 發(fā)酵溫度和蔗糖添加量對感官評價評分影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Effect of the fermentation temperature and amount of suger on sensory evaluation score

從圖1～圖6可以看出，發(fā)酵溫度和蔗糖添加量是影響感官評價的重要因素，接種量次之，復(fù)配比例影響不大。從圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度和復(fù)配比例為中心水平時，蔗糖添加量和接種量的交互作用對感官評價的影響極顯著。其他因素的交互作用對響應(yīng)值影響不大。

圖2 發(fā)酵溫度和接種量對感官評價評分影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Effect of the fermentation temperature and inoculation rate on sensory evaluation score

圖3 發(fā)酵溫度和復(fù)配比例對感官評價評分影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Effect of the fermentation temperature and mixing ratio on sensory evaluation score

圖4 蔗糖添加量和接種量對感官評價評分影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Effect of the amount of suger and inoculation rate on sensory evaluation score

圖5 蔗糖添加量和復(fù)配比例對感官評價評分值影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Effect of the amount of suger and mixing ratio on sensory evaluation score

圖6 接種量和復(fù)配比例對感官評價評分影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Effect of the inoculation rate and mixing ratio on e sensory evaluation score

對回歸方程求導(dǎo)，得到極大值為88.52，對應(yīng)的發(fā)酵溫度為41.18℃，蔗糖添加量為5.17%，接種量為2.90%，復(fù)配比例為（球∶桿）為0.96∶1，為方便實驗，將發(fā)酵溫度定為41.2℃，蔗糖添加量定為5.2%，接種量定為3%，復(fù)配比例定為1∶1。為檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述發(fā)酵條件進行實驗，感官評價評分為89.67±1.53。與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為1.28%。說明該數(shù)學(xué)模型對酸奶發(fā)酵劑的發(fā)酵條件預(yù)測較為準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

通過單因素實驗、Box-Behnken實驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析法，建立響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，此模型對實驗擬合很好。各因素影響感官評價評分的順序為發(fā)酵溫度＞蔗糖添加量＞接種量＞復(fù)配比例。根據(jù)回歸模型，得出了酸奶發(fā)酵劑的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度41.2℃，蔗糖添加量為5.2%，接種量3%，復(fù)配比例1∶1。在此條件下發(fā)酵酸奶，其感官評價評分預(yù)測值為88.52，驗證實驗的酸奶感官評價評分為89.67±1.53。本實驗為分離篩選出的菌株的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為研發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)的酸奶提供了理論依據(jù)。

[1]Larsson C.Effects on product quality for probiotic yoghurts caused by long storage times during production[D].Sweden：Linkoping University，2009.

[2]Oliveiraa M N，Sodini I，Remeuf F，et al.Effect of milk supplementation and culture composition on acidification，textural properties and microbiological stability of fermented milks containing probiotic bacteria[J].International Dairy Journal，2001，11：935-942.

[3]Cakmakci S，Cetin B，Turgut T，et al.Probiotic properties，sensory qualities，and storage stability of probiotic banana yogurts[J].Turk J Vet Anim Sci，2012，36（3）：231-237.

[4]Beal C，Skokanova J，Latrille E，et al.Combined Effects of Culture Conditions and Storage Time on Acidification and Viscosity of Stirred Yogurt[J].Journal of Dairy Science，1999，82：673-681.

[5]Vinderola C G，Mocchiutti P，Reinheimer J A.Interactions Among Lactic Acid Starter and Probiotic Bacteria Used for Fermented Dairy Products[J].Journal of Dairy Science，2002，85：721-729.

[6]包維臣，陳霞，邵玉宇，等.保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌共生機理的研究進展[J].中國乳品工業(yè)，2011，39（12）：20-23.

[7]Panagiotidis P，Koureli R，Tzia C.Industrial Yoghurt Manufacture：Monotoring of Fermentation Process and Improvement of Final Product Quality[J].Journal of Dairy Science，2007，90（6）：2641-2654.

[8]王攀.凝固性羊奶酸奶加工技術(shù)的研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2010.

[9]Celik S，Bakirci H.Some properties of yoghurt produced by adding mulberry pekmez1[J].International Journal of Dairy Technology，2003，56（1）：26-19.

[10]Sahadeva，Leong，Chua，et al.Survival of commercial probiotic strains to pH and bile[J].International Food Research Journal，2011，18（4）：1515-1522.

[11]Andreas O，Alain H，Marcel B，et al.Sensory investigation of yogurt flavor perception：mutual Influence of volatiles and acidity[J].Journal Agricalture Food Chemistry，2000，48（2）：441-450.

[12]Behare P V，Singh R，Tomar S K，et al.Effect of exopolysaccharide-producing strains of Streptococcus thermophilus on technological attributes of fat-free lassi[J].Journal of Dairy Science，2010，93（7）：2874-2879.

[13]生慶海，張愛霞，馬蕊.乳與乳制品感官評價[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2009：74.

[14]蘇雅靜，孫愛東，高雪娟.竹筍殼總黃酮提取工藝的響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2010，31（1）：233-236.

[15]Kristoa E，Biliaderisb C G，Tzanetakisb N.Modelling of the acidification process and rheological properties milk fermented with a yogurt starter culture using response surface methodology[J].Food Chemistry，2003，83：437-446.

[16]徐向宏，何明珠.實驗設(shè)計與Design-Expert、SPSS應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2010：147-160.

[17]John A，Lucey.Cultured dairy products：an ower view of their gelation and texture properties[J].International Journal of Dairy Technology，2004，57：77-84.

[18]Mutlu B，Ak?n S M.Effects of cysteine and different incubation temperatures on the microflora，chemical composition and sensory characteristics of bio-yogurt made from goat’s milk[J].Food Chemistry，2007，100：788-793.

[19]Lee W J，Lucey J A.Structure and Physical Properties of YogurtGels：EffectofInoculation Rate and Incubation Temperature[J].Journal of Dairy Science，2004，87：3153-3164.

[20]Cais-sokolinska D，Michalsk M M，Pikul A.Role of the proportion of yoghurt bacterial stains in milk souring and the formantion of curd qualitative characteristics[J].Bull Vet Inst Pulawy，2004，48：437-441.

[21]秦南冰，李妍，袁珠妮，等.保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的比例變化對酸奶品質(zhì)的影響[J].中國乳品工業(yè)，2011，39（2）：37-40.