唐麗穎 張謀鑫 鄭明城 顏玉緣 陳 煒 謝茂松

血清對大鼠角膜感覺神經(jīng)損傷修復的影響

唐麗穎1張謀鑫1鄭明城1顏玉緣1陳 煒1謝茂松2

1.福建醫(yī)科大學臨床醫(yī)學眼視光學系 2.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科

目的：探討血清對大鼠角膜感覺神經(jīng)損傷修復的影響。方法：SD大鼠40只隨機分為兩組：實驗組和對照組，每組各20只。選取大鼠右眼制作大鼠角膜神經(jīng)損傷模型，實驗組和對照組于損傷后分別用大鼠血清和生理鹽水點眼，每日3次。分別于造模后2d、4d、7d、9d、11d、14d、28d采用自制角膜知覺測定計測量麻醉后大鼠雙眼的角膜知覺，分別于造模后7d、14d、28d采用ELISA法檢測大鼠角膜乙酰膽堿含量。結果：對照組2天、4天、7天的作用力均明顯高于實驗組，說明血清有促進角膜神經(jīng)損傷修復的作用，但組間差異只有第7天的具有統(tǒng)計學意義（=-2.459，=0.028）。實驗組大鼠角膜知覺差不多在受傷后7天就基本恢復，對照組差不多在9～14天才恢復。對照組7天、14天的角膜乙酰膽堿含量低于實驗組，但組間差異只有第7天的具有統(tǒng)計學意義（=2.684，=0.028）。結論：血清可促進大鼠角膜感覺神經(jīng)損傷修復。

大鼠 血清 角膜感覺神經(jīng)損傷 乙酰膽堿

角膜含有豐富的感覺神經(jīng)纖維，當有異物接觸角膜時，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛。若角膜神經(jīng)損傷，就會大大減少角膜對外物接觸的敏感性，使角膜容易受損，引起角膜炎、角膜混濁、角膜潰瘍、角膜穿孔甚至喪失眼球等嚴重后果。角膜神經(jīng)損傷在臨床上十分多見，但目前臨床上尚無可促進角膜神經(jīng)損傷后再生藥物，本實驗通過制作大鼠角膜神經(jīng)損傷模型來探討血清治療大鼠角膜神經(jīng)損傷的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性8周齡SD大鼠40只，體重約250±20g，購自福建醫(yī)科大學實驗動物科學部，按隨機數(shù)字表隨機分為對照組（20只）和實驗組（20只）。

1.2 方法

1.2.1大鼠角膜神經(jīng)損傷動物模型建立

大鼠用速眠新（吉林省華牧動物保健品有限公司）麻醉，在顯微鏡下用直徑為3mm的帶芯角膜環(huán)鉆在角膜中心鉆取一直徑為3mm、深度為0.5mm的環(huán)行切口，注意避免損傷其下的后彈力層和內(nèi)皮層，即制成大鼠角膜神經(jīng)損傷動物模型。采用角膜熒光素染色顯示損傷的區(qū)域，眼前節(jié)分析系統(tǒng)照相并分析損傷區(qū)域的大小。

1.2.2大鼠角膜神經(jīng)損傷后的治療

大鼠角膜神經(jīng)損傷實驗組采用大鼠血清滴眼（大鼠血清制備：大鼠股動脈抽血1mL，靜置30min后釋出血清，1000轉/分離心10min，取上清血清用于滴眼），每日3次；對照組用生理鹽水滴眼，每日3次。

1.2.3角膜知覺測定

造模后2d、4d、7d、9d、11d、14d、28d采用自制的尼龍絲角膜知覺測定計測量大鼠麻醉后的角膜知覺。將角膜知覺測定計的尼龍絲從150mm開始輕輕觸及受檢眼的角膜中央。角膜知覺正常者，尼龍絲彎曲并可立即出現(xiàn)反射性瞬目或有感知。若不發(fā)生瞬目反射或無感知，為角膜知覺消失。如瞬目反射遲鈍或感知不敏感，將尼龍絲從150mm依次逐量（間隔10mm）減少直至10mm，通過標準曲線計算出尼龍絲的作用力，以作用力的大小來反映大鼠角膜知覺敏感度，記錄結果。角膜知覺測定計標準曲線測定：尼龍絲從150mm依次逐量（間隔10mm）減少直至10mm，將尼龍絲輕觸分析天平，測出不同長度尼龍絲彎曲所需的力，以長度為橫坐標，作用力為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4大鼠角膜乙酰膽堿含量檢測

采用ER-1419大鼠乙酰膽堿Elisa試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）檢測大鼠角膜乙酰膽堿含量，取大鼠角膜中央直徑為3mm角膜片（原角膜神經(jīng)損傷區(qū)），加入稀釋液150μL，勻漿，轉速為1000轉/min，時間為10分鐘。高速離心后取50μL加入待測樣品孔，37℃反應120分鐘。每孔加檢測溶液A工作液50μL，37℃反應60分鐘后，再每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）50μL，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2分鐘，150μL/每孔，甩干，依序每孔加底物溶液90μL和終止溶液50μL，而后立即用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.2.5統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠角膜知覺敏感度

對照組2天、4天、7天的作用力均明顯高于實驗組，但組間差異只有第7天的統(tǒng)計學意義，結果見表1。實驗組角膜知覺差不多在受傷后7天就基本恢復，而對照組角膜知覺差不多在9～14天才恢復。

表1 大鼠角膜知覺測定（N）

2.2 大鼠角膜乙酰膽堿含量

對照組7天、14天的角膜乙酰膽堿含量低于實驗組，但組間差異只有第7天的具有統(tǒng)計學意義，結果見表2。

表2 大鼠角膜角膜乙酰膽堿含量（g/mol）

3 討論

角膜知覺檢查方法不斷改進,Boberg-Ans[1]將尼龍線至于一個套管內(nèi)，其游離端的長度和曲度均可改變，垂直眼在角膜表面，直至引起反應為止，經(jīng)校正后即可了解作用的力。本實驗模擬以上的測量方法，分別采用1～15cm（14.523g～0.0268g）的尼龍絲測量實驗組和對照組大鼠的角膜知覺，測量結果為：對照組2天、4天、7天的作用力均明顯高于實驗組，但組間差異只有第7天的統(tǒng)計學意義。由第七天數(shù)據(jù)得知測量引起角膜知覺的平均力量為6.8mg。考慮為大鼠血清中的神經(jīng)生長因子可促進角膜神經(jīng)損傷修復，進而引起角膜知覺的提高。

角膜無色透明，無血管、淋巴管，有豐富的神經(jīng)纖維支配。其中大多數(shù)是副交感神經(jīng)的膽堿能神經(jīng)支配[6]。本實驗通過Elisa檢測對照組和實驗組大鼠經(jīng)過7天、14天、28天后角膜中乙酰膽堿的含量而推測角膜神經(jīng)修復的程度，7天測量結果的差異具有統(tǒng)計學意義?？紤]實驗組的神經(jīng)損傷修復速度明顯大于對照組，即實驗組的角膜勻漿中乙酰膽堿的濃度較大。通過該方法研究角膜知覺損傷修復效果的文獻不多。

知覺是角膜重要的功能之一，具有保護眼前部的作用。角膜營養(yǎng)依賴于完整的感覺神經(jīng)支配，角膜的神經(jīng)支配非常豐富，感覺十分敏銳，損傷可致神經(jīng)營養(yǎng)性角膜病，引起持續(xù)性角膜上皮損傷[2]。血清的生物力學和生物化學特性與正常淚液相同，其可向眼表提供上皮修復所需的基本營養(yǎng)物質血清中含有豐富的細胞生長因子，如表皮生長因子( EGF)、轉移生長因子( TGF) 、成纖維細胞生長因子( FGF) 、神經(jīng)生長因子( NGF) 等，纖維連接蛋白( FN)，維生素A 和E 這些營養(yǎng)物質可以促進眼表上皮的再生和修復，防止角膜潰瘍穿孔的發(fā)生[3]。其中，神經(jīng)生長因子（NGF）是一種強的促細胞分裂因子，能促進神經(jīng)細胞及多種非神經(jīng)元性細胞的增生和分化。自體血清還含有大量氨基酸、核酸關聯(lián)物質, 可以改善組織營養(yǎng), 刺激細胞再生, 加速組織修復[4]。這些表明自體血清可以成為一種很好的淚液替代物, 向眼表修復提供必要的營養(yǎng)物質。

關于角膜知覺研究，Cocher和Bonnet[5]對Boberg-Ans法進行了改進，證實角膜中央閾值平均為10mg，周邊為18mg。本實驗與之相比數(shù)據(jù)偏低，可能因素有尼龍絲的材質、麻醉的深度、偶可對角膜上皮產(chǎn)生損傷等。

綜上所述，自體血清具有來源取材方便、制作簡單、經(jīng)濟、并發(fā)癥少等特點, 滴眼治療促進角膜神經(jīng)損傷的修復和縮短療程。因此, 自體血清是一種理想的治療方法。

[1] Boberg-Ans J. Experience in clinic al examination of corneal sensitivity: comeal sensitivity and the naso-lacrimal reflex after retrobulbar anaesthesia[J]. Br J Ophthalmol, 1955, 39（12）: 705-726.

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[3] 周媛，鄒新蓉.自體血清治療持續(xù)性角膜上皮缺損的臨床分析[J]. 眼外傷職業(yè)眼病雜志, 2010,32（12）：888-890.

[4] 曲忻,郝繼龍.自體血清聯(lián)合糖皮質激素局部應用治療非感染性角膜潰瘍[J]. 中國實用眼科雜志, 2006, 2 ( 3) : 341-342.

[5] 季迅達，朱浩浩，李洪，2型糖尿病角膜知覺減退及其與眼表異常的相關性研究[J]. 眼視光學雜志, 2007，9(2): 97-99.

[6] 郝旖旎，畢燕龍.角膜感覺神經(jīng)及其損傷的研究發(fā)展[J]. Int Rev Ophthalmol, 2011,35(5):307-311.