陸黎明

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復(fù)方黃柏顆粒對養(yǎng)殖場常見致病菌的體外抑菌實驗

陸黎明

廈門泰楓牧業(yè)科技有限公司

本研究的目的是為了探討新型復(fù)方中獸藥復(fù)方黃柏顆粒對養(yǎng)殖場中常見致病菌的體外抑菌效果，結(jié)果表明：復(fù)方黃柏顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、甲型副傷寒沙門氏菌和多殺性巴氏桿菌的最小抑菌濃度（MIC）分別為15.625 μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL，最小殺菌濃度（MBC）分別為>1000μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、1000μg/mL，抑菌圈直徑呈濃度依賴關(guān)系，與MIC結(jié)果基本吻合。復(fù)方黃柏顆粒具有明顯的抑菌效果，同時也為其使用提供了理論依據(jù)。

中獸藥 復(fù)方黃柏顆粒 抑菌 殺菌

使用抗生素、生長促進劑等對畜禽雖具有較滿意的生長速度，但各種疾病疫病的發(fā)生層出不窮，數(shù)量明顯增多，而且沒有傳統(tǒng)意義上的典型癥狀[1]。全球范圍內(nèi)有耐藥性的微生物通過動物食品轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，產(chǎn)生二重感染，從而影響人體健康，世界衛(wèi)生組織（WHO）、歐洲聯(lián)盟委員會、美國食品和藥品管理局（FDA）等機構(gòu)均相繼出臺了各種各樣限制或限量藥物使用的法令。

將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代科技相結(jié)合制成的中藥提取液，正成為獸藥中的新亮點，無抗藥性、無藥物殘留，堪稱新一代高效綠色獸藥[2]。大量科學(xué)實驗證明，許多中草藥不僅本身具有良好的抗菌、抗病毒作用，更可以增強機體器官和組織的屏障防御功能，增強機體的免疫功能，調(diào)節(jié)微生態(tài)，促進微循環(huán)，調(diào)整和提高機體抗病修復(fù)功能和抗病防御功能，達到標(biāo)本兼治、全面增強體質(zhì)的目的。這種獨特的作用，“頭疼醫(yī)頭、腳疼醫(yī)腳”的西藥是無法相提并論的[3]。

復(fù)方黃柏顆粒主要是由黃柏、秦皮、白頭翁等中草藥組成，本研究通過體外抑菌試驗闡明復(fù)方黃柏顆粒對臨床常見致病菌的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗儀器

超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、鼓風(fēng)干燥箱、普通冰箱、電子天平（0.1mg）、游標(biāo)卡尺（規(guī)格0.02mm）、麥?zhǔn)媳葷峁堋⒁淮涡?.22μm微孔濾器（愛爾蘭Millex公司）、磁力攪拌器、pH計。

1.2 試驗材料

1.2.1試驗菌種

金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、甲型副傷寒沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌。

1.2.2試驗藥品

復(fù)方黃柏顆粒劑：主要原料為黃柏、秦皮、白頭翁等中草藥，藥材購自福建回春中藥材公司，應(yīng)用中藥多功能提取器，采用減壓控溫方法，55℃～60℃、-0.05MPa（低壓）條件下水煮、醇提、濃縮，過濾成浸膏，然后經(jīng)過加入載體淀粉（1:1）混合、烘干、粉碎而成，精制后的顆粒劑1g成品相當(dāng)于原生藥0.65g。由實驗室自行制備。

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。按說明書配制備用。

1.3 試驗方法

1.3.1試驗用致病菌菌液的制備

取滅菌生理鹽水5mL左右在滅菌試管中，挑取平板分離4~5個菌落，置于生理鹽水中，振蕩混均后與麥?zhǔn)媳葷峁芟鄬Ρ?，調(diào)整濁度與比濁管相同，此菌液的細(xì)菌相當(dāng)5×107~108CFU/mL。

1.3.2最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用試管內(nèi)藥液倍比稀釋法，即肉湯稀釋法。供試品的第1~10管的濃度以每毫升培養(yǎng)液所含的復(fù)方黃柏顆粒量計。第11管為陽性生長對照管。第12管為培養(yǎng)基對照管。分別將已制備好的金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、甲型副傷寒沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌五種新鮮菌液各0.05mL分別接種于各排1~11管。立即將樣品的所有試管放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，取出各試管，陰性對照與陽性對照均準(zhǔn)確無誤后，再讀取MIC值：以肉眼可見細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為藥物對該菌株的MIC。分別記錄各菌株的MIC值。

1.3.3最小殺菌濃度（MBC）的測定

先測出試驗菌的MIC，再依次將未見細(xì)菌生長各管培養(yǎng)液分別吸取0.1mL，轉(zhuǎn)移到無菌新鮮的瓊脂平皿中，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后觀察結(jié)果，平皿上菌落數(shù)小于5個的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC。

1.3.4抑菌圈的測定與觀察

用滅菌的棉拭子蘸取制備接種菌液，均勻涂布培養(yǎng)基的表面。在無菌條件下，用打孔器在接種后的培養(yǎng)基表面水平輕輕放上不銹鋼小管，靜置20min，在小管內(nèi)注入0.3mL初始稀釋濃度至最小抑菌濃度的藥液，蓋上滅菌瓦蓋，立即水平放入37℃培養(yǎng)箱孵育24h，觀察復(fù)方黃柏顆粒的MIC對五種細(xì)菌的抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測量其直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度（MIC）的測定

37℃培養(yǎng)24h后，各組11號陽性對照管，細(xì)菌生長良好，液體變?yōu)辄S色。12號陰性對照管，無細(xì)菌生長，液體仍保持培養(yǎng)基原有顏色。

金黃色葡萄球菌組第1~7，埃希氏大腸桿菌和嗜水氣單胞菌第1~4，甲型副傷寒沙門氏菌組第1~6，多殺性巴氏桿菌組第1~5支試管澄清，未見細(xì)菌生長所致培養(yǎng)基混濁現(xiàn)象，其余試管均呈不同程度黃色和混濁現(xiàn)象。

復(fù)方黃柏顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、甲型副傷寒沙門氏菌和多殺性巴氏桿菌的MIC分別為15.625μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL，見表1。

2.2 最低殺菌濃度（MBC）的測定

在該稀釋度范圍內(nèi)，除金黃色葡萄球菌，其他各菌均可見不同程度的殺菌作用。復(fù)方黃柏顆粒金黃色葡萄球、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、甲型副傷寒沙門氏菌和多殺性巴氏桿菌的MBC分別為>1000μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、1000μg/mL，見表2。

表1 復(fù)方黃柏顆粒對五種細(xì)菌體外的MIC (μg/mL)

注：“—”代表培養(yǎng)基澄清，不長菌，“+”代表培養(yǎng)基渾濁，長菌。

表2 復(fù)方黃柏顆粒對五種菌的MBC(μg/mL)

2.3 抑菌圈的測定與觀察（見表3與圖1）

表3 復(fù)方黃柏顆粒對五種菌的抑菌圈直徑（mm）

圖1 復(fù)方黃柏顆粒的抑菌圈

復(fù)方黃柏顆粒對這五種致病菌的MIC分別為15.625μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL，MBC分別為>1000μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、1000μg/mL。實驗表明，使用復(fù)方黃柏顆粒針對細(xì)菌性特別是腸道致病菌的疾病，有不同程度的療效。通過MIC和抑菌圈直徑可以發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃柏顆粒的抑菌效果依次是：金黃色葡萄球、甲型副傷寒沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌和嗜水氣單胞菌。

3 討論

白頭翁對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、痢疾桿菌有抑制作用，大劑量能抑制阿米巴滋養(yǎng)體生長。黃柏對痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌等均有抑制作用，對流感病毒、鉤端螺旋體、阿米巴原蟲及皮膚真菌亦有抑制作用。秦皮對痢疾桿菌、傷寒桿菌、肺炎雙球菌、甲型溶血性鏈球菌有較強抑制作用，并有殺阿米巴原蟲的作用4,5]。肖金英等試驗證明黃柏對金黃色葡萄球菌有抑制作用[6]；劉志春等研究發(fā)現(xiàn)秦皮對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌都具有抑菌作用，黃柏對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌都具有抑菌作用，而對綠膿桿菌無抑菌作用[7]；馬廉蘭等發(fā)現(xiàn)秦皮對常見福氏痢疾桿菌和傷寒桿菌具有抑菌作用[8]。實驗證明，白頭翁根的三種不同提取物原白頭翁素、白頭翁總皂苷、白頭翁浸膏均有不同程度的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌較為敏感，對大腸桿菌作用相對較弱[9]。徐藝等研究表明，脾胃病常用方劑中左金丸、香連丸有較強抑菌作用，顯示出一定的根治幽門螺旋桿菌（HP）的作用，提示根治HP并非只能依靠清熱解毒藥，辨證施治，合理組方也可起到很好的根治HP效果[10]。劉玉芹等證實清熱類中草藥板藍根、連翹、敗醬草對大腸桿菌O149K88都顯示出不同程度的體外抗菌活性，由它們組成的復(fù)方的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度較單味藥均有所增強，表明這幾味中草藥在抗菌活性方面具有協(xié)同作用[11]。

將各味中藥進行組方，即相當(dāng)于藥理中的聯(lián)合用藥，目的主要在于擴大抗菌譜、增強療效、減少用量、降低或避免毒副作用，減少或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。試驗表明，復(fù)方黃柏顆粒對養(yǎng)殖上常見的致病菌能夠有效地表現(xiàn)出較強的抑菌和殺菌活性，為臨床作為中獸藥治療使用或作為中草藥飼料添加劑日常使用提供了有效的理論依據(jù)。

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