李思碩 簡(jiǎn)俊伊 程樹(shù)德

以酵母菌雙雜合技術(shù)尋找志賀氏菌IpaH7.8作用蛋白質(zhì)的目標(biāo)蛋白

李思碩 簡(jiǎn)俊伊 程樹(shù)德

臺(tái)灣陽(yáng)明大學(xué)微生物及免疫學(xué)研究所

背景：志賀氏菌感染能造成人類(lèi)出血性腹瀉，此菌常帶有一大型毒性質(zhì)體，以攜帶第三型分泌系統(tǒng)及相關(guān)致病基因，并透過(guò)此系統(tǒng)釋放作用蛋白，協(xié)助菌體侵入人類(lèi)腸壁細(xì)胞，操控細(xì)胞功能，以利在細(xì)胞中存活及增殖。IpaH 家族蛋白是作用蛋白中較特別的一群，志賀氏菌常帶有數(shù)個(gè)IpaH家族基因，除了在毒性質(zhì)體上，經(jīng)常同時(shí)存在染色體上。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，IpaH家族蛋白皆由兩個(gè)功能性區(qū)域組成，其C端均為E3泛素連接酶，而N端在不同IpaH 家族蛋白則具有不同的白氨酸重復(fù)序列，可能結(jié)合不同的目標(biāo)蛋白，最后將其泛素化。其中 IpaH4.5、IpaH7.8、IpaH9.8 在侵入宿主細(xì)胞后才釋放；目前已有研究發(fā)現(xiàn)IpaH4.5和IpaH9.8的目標(biāo)蛋白，其他IpaH蛋白的目標(biāo)蛋白和功能則仍未知，因此我們希望利用酵母菌雙雜合技術(shù)找出IpaH7.8的目標(biāo)蛋白。方法：使用酵母菌雙雜合系統(tǒng)篩選，接著將可能的候選蛋白，以其在細(xì)胞內(nèi)的分布、偽陽(yáng)性的可能性、與IpaH7.8交互作用的強(qiáng)度等，作進(jìn)一步評(píng)估，最后以共同沉淀技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：經(jīng)酵母菌雙雜合系統(tǒng)篩選后，我們得到6個(gè)候選蛋白，其中多數(shù)參與細(xì)胞的代謝反應(yīng)。其中一候選蛋白-RAD50，主要分布在細(xì)胞核，而我們直接在細(xì)胞中表現(xiàn)IpaH7.8 N端和綠色螢光蛋白的融合蛋白，也發(fā)現(xiàn)綠色螢光聚集在細(xì)胞核，因此推測(cè)RAD50為候選蛋白的可能性最高。將IpaH7.8和RAD50進(jìn)行共同沉淀，顯示兩者在生物體外的條件下可互相結(jié)合。

酵母菌雙雜合技術(shù) 志賀氏菌IpaH7.8作用蛋白質(zhì) 目標(biāo)蛋白 共同沉淀法

志賀氏菌為人類(lèi)的病原菌，當(dāng) 10～100 個(gè)菌體感染人類(lèi)時(shí)，即可能造成嚴(yán)重的出血性腹瀉以及發(fā)炎反應(yīng)[1]。其致病性來(lái)自毒性質(zhì)體上所攜帶的第三型分泌系統(tǒng) (Type III secre- tion system) 及相關(guān)致病基因[2]。包含這群基因的片段被稱(chēng)為進(jìn)入?yún)^(qū)域 (Entry region)，當(dāng)此區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活化因子 VirB (第二號(hào)毒性基因，Virulence B)受VirF (第六號(hào)毒性基因，Virulence F) 活化后，會(huì)啟動(dòng)進(jìn)入?yún)^(qū)域的其他基因，以構(gòu)成第三型分泌系統(tǒng)，同時(shí)也活化進(jìn)入?yún)^(qū)域外的osp(外膜蛋白質(zhì)，Outer membrane protein) 家族基因。部分osp家族蛋白已證實(shí)可被釋放至宿主細(xì)胞，降低細(xì)胞的免疫反應(yīng)，協(xié)助志賀氏菌的感染[3-4]。osp家族和ipaA、ipaB、ipaC、ipaD 基因?qū)儆诟腥境跗?(菌體尚未進(jìn)入細(xì)胞前) 最先被分泌的作用蛋白，當(dāng)菌體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，IpgD會(huì)與MxiE結(jié)合，活化另一群作用蛋白的基因，包含部分osp家族，以及ipaH家族，這些作用蛋白被認(rèn)為可抑制細(xì)胞的非專(zhuān)一性免疫反應(yīng)，并減少受感染細(xì)胞的凋亡，幫助細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)存活[5]。

IpaH家族基因在1987年被發(fā)現(xiàn)，在眾多作用蛋白當(dāng)中，IpaH是唯一具有多套(multi-copy)基因的蛋白[6]，且此家族同時(shí)存在毒性質(zhì)體，以及細(xì)菌染色體上。在已定序的志賀氏菌株中，有5個(gè)ipaH家族基因經(jīng)常出現(xiàn)，總基因數(shù)目則因菌株不同而稍有差異[7]，因此Sasakawa等人認(rèn)為此作用蛋白可能具有重要的功能[8]。

IpaH 蛋白約為 60 kD，從結(jié)構(gòu)上可分為 N 端和 C 端兩部分：N 端具有白胺酸重復(fù)序列 (Leucine rich repeat，LRR)，這樣的重復(fù)序列常被用來(lái)與其目標(biāo)蛋白結(jié)合，不同 IpaH 的 N 端則帶有不同的重復(fù)序列；IpaH 家族的 C 端序列則幾乎是相同的，且被發(fā)現(xiàn)具有E3泛素連接酶 (E3 ubiquitin ligase) 的功能[9]。綜合上述推測(cè)，IpaH 家族的不同成員，可能具有將其目標(biāo)蛋白泛素化的功能[10]。

Sasakawa等人在2005年發(fā)現(xiàn)，IpaH9.8會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，借由和U2AF35結(jié)合，影響mRNA的剪接作用 (splicing)，使mRNA無(wú)法成熟(maturation)，進(jìn)而影響介白素8 (interleukin-8)、趨化素 (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted，RANTES)、顆粒單核球群落刺激生長(zhǎng)因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF) 和介白素 1β (interleukin-1β)，以抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[11]；相同團(tuán)隊(duì)在2010年又發(fā)現(xiàn)IpaH9.8可和細(xì)胞質(zhì)中的NEMO和ABIN兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合，NEMO為NF-κB復(fù)合物的前驅(qū)物IKKα-IKKβ 的結(jié)合蛋白，IpaH9.8 可將 NEMO 泛素化，促使其降解，進(jìn)而抑制IL-6的分泌，降低免疫反應(yīng)[12]。

此外，F(xiàn)ernandez-Prada等在 2000 年將志賀氏菌接種至天竺鼠眼球(Sereny test)，觀察正?；蛐?，或分別具有 ipaH4.5或ipaH7.8 基因缺失時(shí)，對(duì)天竺鼠眼球發(fā)炎的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ipaH4.5或ipaH7.8基因缺失皆增強(qiáng)發(fā)炎反應(yīng)，且 ipaH4.5和ipaH7.8同時(shí)剔除將更加劇烈；此論文并未探討其作用機(jī)制，但由此推測(cè)，IpaH7.8可能也和抑制發(fā)炎反應(yīng)有關(guān)。其他研究中則指出，IpaH7.8會(huì)促使吞噬細(xì)胞的凋亡，調(diào)控機(jī)制仍不清楚[13]。

最近，北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所王芳博士的論文《志賀氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子蛋白 IpaH4.5功能研究》，也以酵母菌雙雜合技術(shù)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)其目標(biāo)蛋白為p65，借此降低宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[14]。

本研究以酵母菌雙雜合技術(shù)找尋IpaH7.8可能的結(jié)合蛋白，期望能找到參與免疫反應(yīng)路徑的候選蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞株

E. coli 由益生生技公司購(gòu)買(mǎi)，DH5α菌株作為勝任細(xì)胞和質(zhì)體增殖用，BL21菌株用以生產(chǎn)重組蛋白。酵母菌由陽(yáng)明大學(xué)鄭明媛教授饋贈(zèng)，菌株 Y187 (MATα，ura3-52，his3-200，ade 2-101，trp 1-901，leu 2-3，112，gal4D，met，gal80D，URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-Lac，MEL1)，菌株 PJ69-2A，(MATa， trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4D，gal80D，LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，GAL2UAS- GAL2TATA-ADE2，MEL1)。人類(lèi)均質(zhì)化互補(bǔ)型去氧核糖核酸基因庫(kù) (normalized cDNA library) 由 Clontech 公司購(gòu)買(mǎi)。HeLa 細(xì)胞株由陽(yáng)明大學(xué)林奇宏教授饋贈(zèng)。

1.2 使用基因序列以及質(zhì)體

IpaH7.8 基因由 Shigella flexneri 2457T 經(jīng)聚合鏈酶連鎖反應(yīng)(PCR)取得。于大腸桿菌表現(xiàn)重組蛋白之質(zhì)體 pTAC- MAT-Tag2由Sigma公司購(gòu)買(mǎi)。酵母菌表現(xiàn)用質(zhì)體 pACT-2、pAS2-1、pGBP-9由陽(yáng)明大學(xué)鄭明媛教授饋贈(zèng)。細(xì)胞表現(xiàn)用質(zhì)體 pEGFP-N2 由陽(yáng)明大學(xué)林奇宏教授饋贈(zèng)。

1.3 菌種培養(yǎng)

大腸桿菌菌株皆以 Luria broth (LB) 培養(yǎng)基于 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，制成洋菜平板 (agar plate) 時(shí)則外加 1.2洋菜膠 (agar) 并視需要添加抗生素：ampicillin (50μg/mL) 或 kanamycin (30μg/mL)。如需 IPTG 誘導(dǎo)，細(xì)菌先培養(yǎng)于外加 0.5glucose 及 0.5yeast extract 之 M9 培養(yǎng)基，隔夜后再 1：1 稀釋至含 1mM IPTG 之 LB 培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 2 小時(shí)。

1.4 共軛焦顯微鏡觀察

使用 T-Pro Biotechnology 公司之T-Pro Non-liposome Transfection Reagent 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng) 12～18 小時(shí)后，抽去細(xì)胞之培養(yǎng)液并以 3.7的福馬林溶液 (formaldehyde) 固定，室溫靜置15分鐘，吸去福馬林，再以 PBS 緩沖液沖洗兩次，最后利用 Leica SP5 共軛焦顯微鏡觀察。

1.5 重組蛋白純化

將IpaH4.5或IpaH7.8 接入 pTAC-MAT-Tag2 使其帶有MAT-tag，并轉(zhuǎn)型至 BL21 菌株，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表現(xiàn)后，離心去除培養(yǎng)液，再使用裂解溶液 (lysis buffer：triton X100 1% PMSF 50mM 之 PBS 溶液) 懸浮，利用法式細(xì)胞破碎儀 (French press) 打破菌體，接著離心取上清液，通過(guò) His-Trap FF 管柱純化。

1.6 HeLa 細(xì)胞溶解物 (cell lysates)

將10公分培養(yǎng)盤(pán)之培養(yǎng)液抽去，以PBS溶液沖洗后，加入 200μL RIPA裂解液，刮下細(xì)胞，經(jīng) 4℃、14000 rpm 離心10分鐘，取上清液使用。

1.7 共同沉淀法

使用 TAN Beads公司之His Mag磁珠，經(jīng) RIPA裂解溶液清洗兩次，并懸浮在 RIPA 裂解溶液，再和重組蛋白混合，于 4℃緩慢搖動(dòng)30分鐘后，離心去除上清液；接著將帶有重組蛋白之磁珠加入細(xì)胞裂解物中，經(jīng)4℃緩慢搖動(dòng)1小時(shí)后，離心去除上清液，并以樣本緩沖液 (sample buffer) 將磁珠懸浮，以100℃沸水加熱5分鐘后置冰上冷卻。最后離心去除磁珠，取上清液進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析。

1.8 酵母菌雙雜合系統(tǒng)

使用 Y187和PJ69-2A 兩菌株，其中 Y187 為α型，而 PJ69-2A是a型；兩菌株皆無(wú)法生長(zhǎng)在缺少白胺酸 (leucine)、色胺酸(tryptophan)、腺嘌呤 (adenine)、組胺酸 (histidine) 的培養(yǎng)基上。本研究中所使用的 pGADT7 質(zhì)體帶有 leu2 基因，可使酵母株生長(zhǎng)在缺少白胺酸的培養(yǎng)基上；pAS2-1 和 pGBT9 質(zhì)體則帶有 trp2 基因，可使酵母菌生長(zhǎng)在缺少色胺酸的培養(yǎng)基上。將獵物蛋白和餌蛋白分別接入其中一個(gè)質(zhì)體，并分別轉(zhuǎn)型至 Y187 或 PJ69-2A，經(jīng)交配后，以同時(shí)缺少白胺酸和色胺酸的培養(yǎng)基篩選，即得同時(shí)帶有兩個(gè)質(zhì)體的二倍體。若獵物蛋白和餌蛋白可進(jìn)行交互作用，則菌株可開(kāi)啟質(zhì)體上的下游基因，進(jìn)一步生長(zhǎng)在缺乏腺嘌呤和組胺酸的培養(yǎng)基，若交互作用較強(qiáng)，還可使菌落在含X-α-gal 的培養(yǎng)基上呈藍(lán)色。

1.9 酵母菌培養(yǎng)

一般培養(yǎng)使用 YPAD 培養(yǎng)液；SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu (2SD)、SD/-Trp-Leu-His-Ade (4SD) 培養(yǎng)液分別用于篩選轉(zhuǎn)型后，或交配后可生長(zhǎng)于缺乏特定營(yíng)養(yǎng)源的菌株。X-α-gal (4mg/mL) 則視需要添加。

1.10 酵母菌轉(zhuǎn)型

酵母菌經(jīng) 30℃隔夜培養(yǎng)后，重新接種，于30℃培養(yǎng)至 OD600達(dá)0.4～0.6，離心去除上清液，以無(wú)菌3次水清洗，再離心去除上清液后，以 TE/LiAc 緩沖液清洗，再離心后懸浮于 TE/LiAc 緩沖液，即為酵母菌勝任細(xì)胞；使用1.5mL勝任細(xì)胞，加入150～200μg carrier DNA 和10～50μg質(zhì)體，以及6mL含40PEG3350的TE/LiAc 緩沖液，在30℃培養(yǎng)箱緩慢搖動(dòng)30分鐘，再加入700μL DMSO，并于42℃水浴15分鐘，最后離心去除上清液，以無(wú)菌三次水懸浮，并涂抹在缺乏特定營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基上。

1.11 酵母菌交配

將具有餌蛋白質(zhì)體的酵母菌株接種至100mL的 SD/-Trp 培養(yǎng)液中，30℃隔夜培養(yǎng)，接著離心并重新懸浮為5mL體積，再和OD600約100的帶有獵物蛋白質(zhì)體之酵母菌1mL混合，并加入45mL YPAD培養(yǎng)液，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24小時(shí)。取少量經(jīng)連續(xù)稀釋后涂抹在培養(yǎng)機(jī)上，以計(jì)算交配效率，其余則涂抹于缺乏特定營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基。

1.12 酵母菌菌落聚合酶鏈鎖反應(yīng)

將酵母菌菌落挑入 30μL 0.2SDS溶液中，震蕩15秒后，馬上以95℃隔水加熱4分鐘，于室溫冷卻后，離心取上清液稀釋10倍為DNA樣本。PCR包含一組TUB1引子作為陽(yáng)性控制組，一組 GAL4 引子確認(rèn)餌蛋白質(zhì)體，及一組 cDNA 用引子獲得基因庫(kù)嵌入片段。

2 結(jié)果

2.1 酵母菌轉(zhuǎn)型及交配效率

酵母菌交配完成后，經(jīng)連續(xù)稀釋?zhuān)瑢⒕悍謩e涂在 YPDA、SD/-Leu、SD/-Trp、2SD 上，以計(jì)算交配效率，回推所得的二倍體數(shù)目約16000個(gè)。進(jìn)一步篩選有交互作用者，得到264個(gè)陽(yáng)性菌落，再經(jīng)由酵母菌菌落聚合鏈酶連鎖反應(yīng)確認(rèn)，得到68個(gè)菌落帶有cDNA資料庫(kù)嵌入片段。進(jìn)一步分析嵌入片段長(zhǎng)度，并利用限制酶處理，區(qū)分不同嵌入片段，最后選出28個(gè)不同的cDNA嵌入片段。

2.2 候選蛋白篩選

經(jīng)定序后發(fā)現(xiàn)，并非所有嵌入片段都和活化區(qū)域?qū)儆谕婚_(kāi)放閱讀框架 (open reading frame)，因此最后得到 6 個(gè)可轉(zhuǎn)譯出長(zhǎng)片段的候選蛋白 (見(jiàn)表1)。

表1 利用酵母菌雙雜合系統(tǒng)所得 6個(gè)可轉(zhuǎn)譯出長(zhǎng)段的候選蛋白（其中部分候選蛋白僅包含全長(zhǎng) cDNA 之一部分）

為進(jìn)一步分析交互作用強(qiáng)度，我們分別制作帶有 pAS2- 1-IpaH7.8N(高量表現(xiàn)IpaH7.8 N端的質(zhì)體)、pGBT9- IpaH7.8N (低量表現(xiàn)IpaH7.8 N 端的質(zhì)體)、pGBT9-IpaH7.8 (低量表現(xiàn) IpaH7.8全長(zhǎng)的質(zhì)體) 的酵母菌株，與帶有候選蛋白質(zhì)體的酵母菌株進(jìn)行交配。

若交配后僅表現(xiàn)his3基因，會(huì)因生成腺嘌呤的前導(dǎo)物累積，而呈現(xiàn)紅色菌落，我們將此狀況的交互作用的強(qiáng)度定為 1 分；若可開(kāi)啟his3和ade2兩基因，則菌落呈現(xiàn)白色，定為 2 分；若可開(kāi)啟his3、ade2、mel1三個(gè)基因，則可在含 X-α-gal 的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，定為3分。結(jié)果顯示候選蛋白中的 WBP5 和 OLFML3與IpaH7.8 N 端有最強(qiáng)的交互作用 (見(jiàn)圖1)。

紅色菌落 1 分開(kāi)啟 his3 白色菌落 2 分開(kāi)啟 his3 + ade2 藍(lán)色菌落 3 分開(kāi)啟 his3 + ade2 + mel1

2.3 IpaH7.8 與候選蛋白在細(xì)胞中的分布

在真實(shí)的情況下，若兩個(gè)蛋白發(fā)生交互作用，則需同時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞的相同區(qū)域。因此我們分別在 HeLa 細(xì)胞株直接表現(xiàn)與綠色螢光蛋白融合的全長(zhǎng) IpaH7.8，或只有 IpaH7.8 N 端，并利用共軛焦顯微鏡確認(rèn)。結(jié)果表現(xiàn)全長(zhǎng)的融合蛋白時(shí)，螢光強(qiáng)度偏低，難以判讀，但表現(xiàn) IpaH7.8 N 端的融合蛋白時(shí)，綠色螢光有聚集在細(xì)胞核的現(xiàn)象 (圖2)。接著，我們查詢(xún)基因本體 (Gene Ontology) 系統(tǒng)中對(duì)候選蛋白在細(xì)胞中分布的描述，發(fā)現(xiàn)其中 RAD50 會(huì)出現(xiàn)在細(xì)胞核。

圖2 在 HeLa 細(xì)胞中直接表現(xiàn) IpaH7.8 N 端和綠螢光蛋白的融合蛋白，顯示綠色螢光聚集在細(xì)胞核中。左為相位差影像，右為綠色螢光影像。

2.4 以共同沉淀法驗(yàn)證候選蛋白

我們進(jìn)一步在候選蛋白的N端接上FLAG標(biāo)記，轉(zhuǎn)染入 HeLa細(xì)胞表現(xiàn)，另一方面利用大腸桿菌生產(chǎn)帶有MAT 標(biāo)記的IpaH7.8的重組蛋白，以共同沉淀法驗(yàn)證兩者在生物體外的環(huán)境下是否發(fā)生交互作用。由西方墨點(diǎn)法結(jié)果顯示，含有 IpaH7.8的重組蛋白的確可和RAD50結(jié)合，而改以IpaH4.5 重組蛋白取代，便無(wú)法得到RAD50 (見(jiàn)圖3)。

RAD50 Mock IpaH7.8IpaH4.5 IpaH7.8IpaH4.5 Total lysateSupernatantPelletSupernatantPellet Total lysateSupernatantPelletSupernatantPellet Anti Flag-Tag Anti tubulin

3 討論

從交互作用強(qiáng)度、候選蛋白在細(xì)胞中的分布、共同沉淀等結(jié)果來(lái)說(shuō)，在我們的候選蛋白中，RAD50是可能性最高的。過(guò)去研究指出，RAD50會(huì)與MRE11和NBN 蛋白形成復(fù)合物[15]，辨認(rèn)DNA雙股斷裂處，進(jìn)行 DNA 修復(fù)，同時(shí)也會(huì)透過(guò) ATM 蛋白調(diào)控細(xì)胞周期，使細(xì)胞停留在DNA 合成期 (S phase) 之前[16]。若RAD50受IpaH7.8的結(jié)合并接上泛素，可能會(huì)改變其功能，或吸引其他因子與RAD50結(jié)合[17]，而停止細(xì)胞周期。如志賀氏菌的另一個(gè)分泌蛋白 IpaB，可透過(guò)與Mad2L2的作用，使宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期停止，避免宿主細(xì)胞內(nèi)的志賀氏菌因細(xì)胞分裂而有機(jī)會(huì)被排除在細(xì)胞外[18]。

我們?cè)认Ｍ诤蜻x蛋白中看到參與調(diào)控免疫機(jī)制的蛋白，但最后并未發(fā)現(xiàn)，從酵母菌雙雜合技術(shù)層面來(lái)說(shuō)，可能一開(kāi)始篩選得的二倍體數(shù)目并未完整涵蓋人類(lèi)的轉(zhuǎn)錄體 (transcriptome)，因而錯(cuò)失真正的目標(biāo)蛋白，或者其目標(biāo)蛋白在酵母菌表現(xiàn)后影響酵母菌生長(zhǎng)，而難以被培養(yǎng)出，這兩點(diǎn)也是酵母菌雙雜合技術(shù)經(jīng)常遇到的基本問(wèn)題；此外，也可能 IpaH7.8并不直接調(diào)控免疫反應(yīng)，而是透過(guò)其他途徑間接影響。若多重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，收集更多候選蛋白加以分析，或有較多機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)IpaH7.8在細(xì)胞中的目標(biāo)蛋白。

[1] DuPont HL LM, Hornick RB, Formal SB. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission[J]. J Infect Dis, 1989, 159(6):1126-1128.

[2] P J Sansonetti DJK, S B Formal. Involvement of a plasmid in the invasive ability of Shigella flexneri[J]. Infect Immun, 1982, 35(3):852–860.

[3] Hromockyj AE MA. Identification of Shigella invasion genes by isolation of temperature-regulated inv::lacZ operon fusions[J]. Infect Immun, 1989, 57 (10):2963-2970.

[4] Venkatesan MM BJ, Oaks EV. Surface presentation of Shigella flexneri invasion plasmid antigens requires the products of the spa locus[J]. J Bacteriol, 1992, 174(6):1990-2001.

[5] Le Gall T, Mavris M, Martino MC, Bernardini ML, Denamur E, Parsot C. Analysis of virulence plasmid gene expression defines three classes of effectors in thetype III secretion system of Shigella flexneri[J]. Microbiology, 2005, 151(Pt 3): 951-962.

[6] Hartman AB, Venkatesan M, Oaks EV, Buysse JM. Sequence and molecular characterization of a multicopy invasion plasmid antigen gene, ipaH, of Shigella flexneri[J]. Journal of bacteriology, 1990, 172(4):1905-1915.

[7] Jin Q YZ, Xu J, Wang Y, Shen Y, Lu W, Wang J, Liu H, Yang J, Yang F, Zhang X, Zhang J, Yang G, Wu H, Qu D, Dong J, Sun L, Xue Y, Zhao A, Gao Y, Zhu J, Kan B, Ding K, Chen S, Cheng H, Yao Z, He B, Chen R, Ma D, Qiang B, Wen Y, Hou Y, Yu J. Genome sequence of Shigella flexneri 2a:insights into pathogenicity through comparison with genomes of Escherichia coli K12 and O157[J]. Nucleic Acids Res, 2002, 30(20):4432- 4441.

[8] Ashida H, Toyotome T,Nagai T, Sasakawa C. Shigella chromosomal IpaH proteins are secreted via the type III secretion system and act as effectors[J]. Molecular microbiology, 2007, 63(3):680-693.

[9] Venkatesan MM BJ, Hartman AB. Sequence variation in two ipaH genes of Shigella flexneri5 and homology to the LRG-like family of proteins[J]. Mol Microbiol, 1991, 5(10):2435-2445.

[10] Bell JK, Mullen GED, Leifer CA, Mazzoni A, Davies DR, Segal DM. Leucine-rich repeats and pathogen recognition in Toll-like receptors[J]. Trends in Immunology, 2003, 24(10):528-533.

[11] Okuda J, Toyotome T, KataokaN, Ohno M, Abe H, Shimura Y, Seyedarabi A, Pickersgill R, Sasakawa C. Shigella effector IpaH9.8 binds to a splicing factor U2AF(35) to modulate host immune responses[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2005, 333(2):531-539.

[12] Ashida H, Kim M, Schmidt-Supprian M, Ma A, Ogawa M, Sasakawa C. A bacterial E3 ubiquitin ligase IpaH9.8 targets NEMO/IKK gamma to dampen the host NF-kappaB-mediated inflammatory response[J]. Nature cell biology, 2010, 12(1):66-73; sup pp 61-69.

[13] Fernandez-Prada CM, Hoover DL, Tall BD, Hartman AB, Kopelowitz J, Venkatesan MM. Shigella flexneri IpaH(7.8) facilitates escape of virulent bacteria from the endocytic vacuoles of mouse and human macrophages[J]. Infection and immunity, 2000, 68(6):3608-3619.

[14] WANG Fang MH-F, HE Xiang,YUAN Xi-Tong,JIANG Zeng,LIU Da-We, ZHAO Jiang-Li, ZHAO Hong-Qing, YUAN Jing, ZHONG Hui, HUANG Liu-Yu. Functional Analysis of Type ⅢSecretion System Effector IpaH4.5 of Shigella flexneri. China Paper 2010.

[15] Haber JE. The many interfaces of Mre11[J]. Cell, 1998, 95(5):583.

[16] Lim DS, Kim ST, Xu B, Maser RS, Lin J, Petrini JHJ, Kastan MB. ATM phosphorylates p95/nbs1 in an S-phase checkpoint pathway[J]. Nature, 2000, 404(6778):613-617.

[17] Dianov G, Meisenberg C, Parsons J. Regulation of DNA repair by ubiquitylation[J]. Biochemistry (Moscow), 2011, 76(1):69-79.

[18] Iwai H, Kim M, Yoshikawa Y, Ashida H, Ogawa M, Fujita Y, Muller D, Kirikae T, Jackson PK, Kotani S. A bacterial effector targets Mad2L2, an APC inhibitor, to modulate host cell cycling[J]. Cell, 2007, 130(4):611-623.