王成龍　蘇東華　劉佼佼等

[摘要] 目的 分離鑒定變異鏈球菌臨床分離株。方法 收集高齲患者和無齲健康人口腔中牙菌斑標本進行厭氧培養(yǎng)，通過細菌形態(tài)學觀察、生物化學鑒定、自動微生物分析系統(tǒng)分析、聚合酶鏈反應（PCR）擴增變異鏈球菌基因的特異性片段表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（spaP）、葡糖基轉移酶B（gtfB）和葡聚糖酶（dexA）以及基因分型等方法對獲得的變異鏈球菌臨床分離株進行鑒定。結果 從32例臨床受試者口腔中分離獲得46株變異鏈球菌臨床分離株，經(jīng)生物化學，自動微生物分析系統(tǒng)，變異鏈球菌的特異性基因spaP、gtfB和dexA的PCR擴增均鑒定為變異鏈球菌，基因分型發(fā)現(xiàn)其中5株臨床分離株的基因型與其他菌株相同。結論 獲得41株不同基因型變異鏈球菌臨床分離株。

[關鍵詞] 變異鏈球菌； 基因型； 分離； 鑒定

[中圖分類號] R 780.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.020 變異鏈球菌（Streptococcus mutans）是人類口腔中最主要的致齲菌[1]。變異鏈球菌群中各菌種的分離與

鑒定是進行齲病研究的基礎。細菌菌種的鑒定方式經(jīng)歷了由傳統(tǒng)的表型、血清型方法到以分子生物學為基礎的基因型方法的轉變。本文采用形態(tài)學、生物化學、自動微生物分析系統(tǒng)、擴增變異鏈球菌基因的特異性片段區(qū)域以及基因分型等方法對獲得的變異鏈球菌臨床分離株進行鑒定，為齲病臨床和基礎研究提供材料。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

變異鏈球菌國際參考株Ingbritt（首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學研究所提供），金黃色葡萄球菌臨床分離株188號（軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所生物化學與分子生物學研究室提供）。

1.2 病例選擇

納入標準：高齲患者，齲失補牙（decayed-mis-sing-filled-tooth，DMFT）指數(shù)≥6；無齲健康人，

DMFT指數(shù)=0。排除標準：飲食結構異常，有嗜甜

食（飲）及睡前進餐等不良飲食習慣者；接受放療和化療的患者；舍格倫綜合征患者；嚴重全身系統(tǒng)性疾病者；近3個月內服用抗生素者；接受正畸治療者；口腔衛(wèi)生狀況不良者；牙齒結構異常者；涉及取樣的牙體有牙髓病變、根面暴露或根面齲、未控制的牙周病變、冠或固定橋等修復體者。

根據(jù)納入及排除標準，從臨床初次就診的患者中選取受試者，受試者的取樣位點均為無齲損的釉質光滑面。采集菌斑前，均向受試者及其陪同人員說明實驗目的和過程，取得同意并簽署知情同意書。

40例受試者參加實驗，其中高齲患者26例（DMFT指數(shù)為7.40±2.07），無齲健康人14例。

1.3 菌斑采集與處理

受試者清水漱口，去除食物殘渣，棉卷隔濕并用無菌生理鹽水沖洗收集區(qū)，更換棉卷，隔濕，用無菌刮匙刮取釉質光滑面菌斑后，立即將其置于預先消毒滅菌，盛有1 mL改良液體Cary-Blair運送培養(yǎng)基，上覆液體石蠟的Eppendorf管中密封。標本在2 h內轉送至實驗室。所取的菌斑樣本經(jīng)振蕩器混勻1 min后，用無菌生理鹽水做10倍系列稀釋。

1.4 變異鏈球菌的分離

1.4.1 細菌初代培養(yǎng) 取原液、10-1、10-2、10-3稀釋液各100 μL，接種于胰蛋白酶水解物-酵母提取物-半胱氨酸-蔗糖-桿菌肽瓊脂（tryptone-yeast extract-cysteine with sucrose and bacitracin agar，TYCSB）培養(yǎng)平板[2]內，置于厭氧環(huán)境（體積分數(shù)80%N2、10%H2、10%CO2）下37 ℃培養(yǎng)48 h，然后進行菌落形態(tài)的觀察。

1.4.2 細菌次代純化培養(yǎng) 將經(jīng)初代培養(yǎng)的具有典型菌落形態(tài)的單個菌落接種于輕型唾液鏈球菌-桿菌肽瓊脂（mitis salivarius with bacitracin agar，MSB）

培養(yǎng)平板[2]內，置于厭氧環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)48 h，然后

進行菌落形態(tài)的觀察及革蘭染色檢查。

1.5 變異鏈球菌臨床分離株的鑒定

1.5.1 形態(tài)學鑒定 純化培養(yǎng)的細菌經(jīng)革蘭染色，于油鏡（100×10）下觀察菌體染色、形狀和排列情況。

1.5.2 生化鑒定 用無菌接種環(huán)收集培養(yǎng)48 h的MSB培養(yǎng)平板表面的菌落（經(jīng)鏡下觀察證實為純化培養(yǎng)

物），混懸于1.0 mL的無菌生理鹽水中制成0.5麥氏濁度的均一細菌懸液。取待測細菌懸液分別滴入需要實驗的盛有甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖、七葉苷和精氨酸的安瓿瓶中，每瓶3滴，以進行臨床分離株的糖酵解實驗和水解實驗，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結果。此外，將菌懸液滴加于清潔的載玻片上后，滴加體積分數(shù)3%過氧化氫，觀察有無氣泡產(chǎn)生。以變異鏈球菌國際參考株Ingbritt為陽性對照，無菌生理鹽水為陰性對照。

1.5.3 自動微生物分析系統(tǒng)鑒定 經(jīng)傳統(tǒng)生化鑒定確定為變異鏈球菌的臨床分離株，再分別用API 20 Strep鑒定條或VITEK 2全自動微生物分析儀進一步鑒定，以確保結果的準確性。實驗方法參照儀器使用說明書進行。API 20 Strep的結果分別于4 h和24 h讀??；VITEK 2全自動微生物分析儀的測定結果于8 h內讀取。經(jīng)上述鑒定方法證實為變異鏈球菌者，用體積比1∶1的甘油腦心浸液（brain-heart infusion，BHI）液體培養(yǎng)基保種，于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 分子生物學鑒定 通過聚合酶鏈式反應（poly-

merase chain reaction，PCR）方法擴增變異鏈球菌基因的特異性片段區(qū)域，包括表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（sur-face protein antigen Ⅰ/Ⅱ，spaP）基因[3]、葡糖基轉移酶B（glucosyltransferase B，gtfB）基因[4]和葡聚糖酶（dextranase，dexA）基因[5]，目的片段大小分別為192、517和1 272 bp。以變異鏈球菌國際參考株Ingbritt為陽性對照，金黃色葡萄球菌臨床分離株188號為陰性對照。

引物的設計：根據(jù)GenBank提供的基因序列并參考文獻，設計spaP[3]、gtfB[4]和dexA[5]特異性引物（表1），由美國Invitrogen公司中國分公司合成。

細菌基因組DNA的提?。焊鶕?jù)參考文獻[3-5]提取細菌基因組DNA，用紫外分光光度儀進行定量測定。

以基因組DNA為模板，通過合成的特異性引物，利用PCR的方法，從中釣取目的基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR反應體系：10×Taq Buffer 5 μL，dNTP（每種核苷酸2.5 mmol·L-1）4 μL，上游引物

（25 pmol·μL-1）1 μL，下游引物（25 pmol·μL-1）1 μL，基因組DNA 1.5 μL，Taq DNA聚合酶（2 U·μL-1）

0.5 μL，加滅菌去離子水補齊至50 μL；PCR反應條件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共30個循環(huán)反應。

1.5.5 基因分型鑒定[6] 使用OPA5引物[7]（5-AGG-GGTCTTG-3）以隨機引物PCR完成基因分型鑒定。

PCR反應體系：5 μL 10×Taq Buffer，300 μmol·L-1 dNTP（每種核苷酸2.5 mmol·L-1），100 pmol引物，5 μL基因組DNA，5 U Taq DNA聚合酶，加滅菌去離子水補齊至50 μL；PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，36 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，共35個循環(huán)反應。擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，Photo system EAGLE EYE Ⅱ（Stra-tagene公司，美國）記錄圖像，BioNumerics數(shù)據(jù)庫軟件進行圖像處理，經(jīng)程序統(tǒng)一的相對分子質量標準進行校準，標定條帶位置，必要時進行手工校正。每兩個圖像之間的相似性系數(shù)用Dice系數(shù)表示，相似性系數(shù)設定為95%。

2 結果

2.1 菌落檢測及細菌形態(tài)學鑒定

菌落肉眼觀察結果：細菌初代培養(yǎng)時，TYCSB平板上的菌落為較小的白色菌落，邊界清楚（圖1A）；細菌次代純化培養(yǎng)時，MSB平板上的菌落為深藍色，嵌頓于培養(yǎng)基內，質硬，表面粗糙且突起，邊緣不齊，形成“霜玻璃”樣外形（圖1B）。經(jīng)革蘭染色，

鏡下觀察可見，菌落為革蘭陽性小球菌，多呈短鏈狀，成對或分散排列（圖1C）。

從形態(tài)學觀察，26例高齲患者中22例檢出變異鏈球菌，從其中的10例受試者分別挑取1株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，另外10例受試者分別挑取2株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，最后2例受試者分別挑取3株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，共36株；14例無齲健康人中有10例檢出變異鏈球菌，分別挑取1株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，共10株。將上述46株形態(tài)典型的變異鏈球菌臨床分離株依次編號（1～46號），進行下一步研究。

2.2 細菌生化鑒定

對形態(tài)學觀察具有變異鏈球菌典型形態(tài)的臨床分離株，進行傳統(tǒng)的生化鑒定。甘露醇、山梨醇、棉子糖和密二糖的發(fā)酵實驗陽性者為黃色，七葉苷水解實驗陽性者為黑色，精氨酸水解實驗陽性者為紅色，加3%過氧化氫后產(chǎn)生大量氣泡者為觸媒實驗陽性。主要生化特性鑒定見表2。46株變異鏈球菌臨床分離株與變異鏈球菌國際參考株Ingbritt對各個生化試劑的反應結果相同。

2.3 自動微生物分析系統(tǒng)鑒定

分別采用半自動API 20 Strep鑒定條和全自動VITEK 2微生物分析儀對已經(jīng)過傳統(tǒng)生化反應初步鑒定為變異鏈球菌的臨床分離株進行鑒定，其結果見表3。API 20 Strep結果中的鑒定百分比是將菌株的生化反應與資料庫中的所有菌株比對的結果，即為鑒定概率。鑒定百分比的值越高，結果越吻合。表3中T值為同一菌株各項生化反應的典型程度，反應鑒定的可靠性；T值越接近1，菌株生化反應的程度越典型。由表3可見：國際參考株Ingbritt的鑒定概率為99.9%，T值為1，概率生物為99.00%，可信度為優(yōu)質可信，說明半自動API 20 Strep鑒定條和全自動VITEK 2微生物分析儀的鑒定結果是可信的。除菌株1的T值為0.90、概率生物為94.50%，菌株2的T值為0.78，菌株3的T值為0.80、概率生物為91.15%、可信度為可信，菌株4的T值為0.90、概率生物為94.95%，菌株5的T值為0.75外，其余菌株的T值均在0.91和1之間，概率生物在95.00%和98.00%之間，可信度為優(yōu)質可信或非?？尚牛f明經(jīng)自動微生物分析系統(tǒng)鑒定的臨床分離株1～46均為變異鏈球菌。

2.4 分子生物學鑒定

分別以變異鏈球菌國際參考株Ingbritt、金黃色葡萄球菌臨床分離株188號和經(jīng)鑒定為變異鏈球菌臨床分離株的細菌基因組DNA為模板，以合成的spaP-F（R）、gtfB-F（R）和dexA-F（R）為引物，進行PCR擴增。分別將各菌株的3個PCR產(chǎn)物進行電泳，電泳圖譜顯示46株變異鏈球菌臨床分離株及陽性對照變異鏈球菌國際參考株Ingbritt的擴增產(chǎn)物均為單一條帶，其大小分別為192、517和1 272 bp（圖2），與預期相同；而陰性對照金黃色葡萄球菌臨床分離株188號無目的條帶出現(xiàn)。

2.5 基因分型鑒定

使用OPA5引物以隨機引物PCR擴增46株變異鏈球菌臨床分離株基因組DNA，進行基因分型鑒定，結果顯示：46株臨床分離株中，有5株變異鏈球菌的基因型與其他菌株相同。46株臨床分離株和5株與其他菌株基因型相同的臨床分離株的來源見表4。去除5株與其他菌株基因型相同的變異鏈球菌臨床分離株菌，本實驗獲得41株基因型不同的變異鏈球菌臨床分離株，其基因分型分析結果見圖3。圖3中電泳條帶上面的橫線表示菌株的相似度，豎線指示的是每一個菌株及相似度相同的菌株，由此可以得出46株臨床分離株基因分型的相似程度。

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織關于齲病流行嚴重程度的標準[8]，并參考其他文獻[9]，本研究將DMFT指數(shù)≥6者確定為高齲患者，DMFT=0者確定為無齲健康人。

本研究采用的研究樣本為牙菌斑，取樣位點為受試者口腔內無齲損的釉質光滑面。研究[10]表明：牙

菌斑和唾液樣本是良好的口腔變異鏈球菌研究對象。本研究的目的是為了獲得確實可靠的變異鏈球菌臨床分離株，且齲病形成的先決條件是牙菌斑的形成，所以采用牙菌斑作為研究樣本。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)：變異

鏈球菌的定植存在部位差異性，完整的牙齒表面和齲壞牙面以及牙冠不同部位，變異鏈球菌的數(shù)量和比例都是不同的。為了避免因部位因素而影響菌斑中變異鏈球菌檢出情況，本研究的取樣位點均為無齲損的釉質光滑面。

口腔中的菌群數(shù)量多、種類復雜，為了能夠從牙菌斑中獲得變異鏈球菌的純培養(yǎng)物，本研究采用具有選擇及鑒定功能的培養(yǎng)基進行細菌的分離與培養(yǎng)。研究[1]表明，變異鏈球菌和表兄鏈球菌（Strepto-coccus sobrinus，又稱遠緣鏈球菌或茸毛鏈球菌）是人類最主要的致齲菌，是具有相似表型特征而遺傳型和分子組成不同的異源性細菌。雖然變異鏈球菌在人類口腔中的檢出率最高，可達90%以上，但表兄鏈球菌的檢出率也可達10%～76%，因此，本研究中細菌培養(yǎng)的重點在于區(qū)分上述兩種細菌。研究[2]證實，TYCSB培養(yǎng)基在變異鏈球菌培養(yǎng)方面與其他選擇性培養(yǎng)基比較具有高靈敏性、高特異性及保存時間相對較長的特點，并且通過菌落形態(tài)的差異可以區(qū)分出變異鏈球菌與表兄鏈球菌。本研究在細菌初代培養(yǎng)時采用TYCSB培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)兩種典型的菌落形態(tài)，一種為較小的邊界清楚的白色菌落，另一種為邊界模糊的黃白色菌落。因為該培養(yǎng)基中添加了可以有效抑制牙菌斑中大部分細菌生長的桿菌肽和高濃度蔗糖[13]，所以上述兩種形態(tài)的菌落可能是來源

于變異鏈球菌和表兄鏈球菌。雖然MSB培養(yǎng)基不能明顯區(qū)分以上兩個菌種且保存時間較短，但仍是分離培養(yǎng)變異鏈球菌時應用最為廣泛的培養(yǎng)基；因此，本研究將具有典型菌落形態(tài)的單個菌落分別接種于MSB培養(yǎng)基進行次代純化培養(yǎng)。次代培養(yǎng)后，可看到兩種菌落形態(tài)：一種菌落呈深藍色嵌頓狀態(tài)，質硬，表面粗糙有突起，邊緣不齊；另一種為藍褐色，突起，表面覆蓋有水滴樣的蓋帽狀物。經(jīng)革蘭染色鏡下觀察，兩種菌落均為格蘭陽性小球菌，前者多呈短鏈狀，成對或分散排列；后者長鏈狀居多，成對或鏈狀排列，與文獻[14]報道相近。綜合選擇性培

養(yǎng)基上菌落形態(tài)及革蘭染色觀察所見，可以初步認定變異鏈球菌的菌落特征為：TYCSB培養(yǎng)基上為較小的邊界清楚的白色菌落，MSB培養(yǎng)基上為深藍色嵌頓、質硬、表面粗糙有突起、邊緣不齊的菌落，鏡下觀察呈短鏈狀，成對或分散排列。

為確保分離培養(yǎng)出的變異鏈球菌臨床分離株的可靠性，本研究采用從傳統(tǒng)的生化反應到自動微生物分析系統(tǒng)再到分子生物學等多種方法對其進行鑒定。生化反應鑒定結果顯示：46株臨床分離株符合變異鏈球菌的生化特性。API 20 Strep鑒定條或VITEK 2全自動微生物分析儀分析均為目前臨床微生物檢

驗時常用的微量快速且具有高準確性的鑒定方法，其中API 20 Strep手工鑒定條更被認為是細菌鑒定的全球標準。本研究結果顯示：盡管各菌株的鑒定概率有一定程度的差別，但均被證實為變異鏈球菌；其中，VITEK 2分析儀的鑒定概率小于API 20 Strep的原因可能是由于兩種方法對準確率的初始設置不同所致。PCR技術具有高特異性、高敏感性的特點，對于細菌的鑒定具有獨特的優(yōu)勢。目前已經(jīng)用于變異鏈球菌鑒定的基因片段有表面蛋白spa基因[3]、葡

糖基轉移酶gtf基因[4]、葡聚糖酶dex基因[5]和16S rRNA基因[15]等。spaP基因表達的變異鏈球菌表面蛋白能

夠促進該菌對牙面的黏附與定植；gtfB基因表達的非水溶性葡糖基轉移酶有利于蔗糖作為底物合成水不溶性葡聚糖，后者參與了該菌的蔗糖依賴性黏附；dexA基因表達的葡聚糖酶不僅可降解葡聚糖提供營養(yǎng)物質，而且可以與葡聚糖結合使該菌保持更加牢固且易黏附的形式。本研究選用spaP、gtfB和dexA基因作為目的基因進行PCR擴增，結果顯示：46株變異鏈球菌臨床分離株及國際參考株Ingbritt的擴增產(chǎn)物均為單一條帶，目的片段大小與文獻報道一致[3-5]，

而陰性對照菌株無目的條帶出現(xiàn)。該結果證實46株臨床分離株均為變異鏈球菌。

經(jīng)過細菌形態(tài)學、生化反應、自動微生物分析系統(tǒng)和分子生物學鑒定的變異鏈球菌臨床分離株，有可能具有相同的基因型；本研究使用OPA5引物以隨機引物PCR對46株變異鏈球菌臨床分離株進行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)5株變異鏈球菌臨床分離株基因型與其他菌株相同。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)：口腔中變異鏈球

菌基因型數(shù)量與患齲情況有關，患齲者多于無齲者；口腔環(huán)境的變化對變異鏈球菌基因型的數(shù)量也有影響，暴露于蔗糖環(huán)境者變異鏈球菌基因型數(shù)量多于暴露于水環(huán)境者。本研究發(fā)現(xiàn)的5株相同基因型的變異鏈球菌均來源于同一受試者中分離培養(yǎng)多于1株的受試者，而不同受試者的基因型不同。經(jīng)過基因型鑒定，剔除5株基因型相同的變異鏈球菌臨床分離株后，本研究得到了41株基因型不同的變異鏈球菌臨床分離株，可以用于齲病臨床和基礎研究。

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（本文編輯 吳愛華）