蔡文韜 夏延斌 夏 菠 易有金 任佐華

CAIWen-tao XIA Yan-bin XIA Bo YIYou-jin REN Zuo-hua

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128）

(Hunan Agricultrue University,Changsha,Hunan 410128,China)

鏈格孢菌是茄科植株中危害較大的病害之一。該病不僅發(fā)生在田間，更是采后貯藏過程中的重要性病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科類果蔬[1，2]，侵害途徑主要是通過氣孔、皮孔、傷口或表皮侵入果實，在適宜條件下產(chǎn)生大量孢子，對果實造成嚴(yán)重危害[3]。目前主要采用化學(xué)法進(jìn)行防治，但是長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會造成環(huán)境污染，也會使得病原菌的抗藥性增強(qiáng)[4]，果蔬上殘留的農(nóng)藥也會對人體健康產(chǎn)生危害[5，6]。因此，利用生物法進(jìn)行果蔬采后病害防控，得到越來越多的關(guān)注。

植物內(nèi)生菌是一類適宜在植物體內(nèi)生長的微生物，一般具有較高的安全性，其中部分菌株具有潛在的抗病菌的能力[7]。近年來，利用植物內(nèi)生細(xì)菌防治植物土傳病的研究已取得較大進(jìn)展。但是對利用微生物進(jìn)行果蔬采后保鮮方面的研究甚少，且多數(shù)集中在細(xì)菌如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等生物防治方面，并取得了較好的成果。劉杰鳳等[8]從番茄、辣椒、茄子中分離出14株對青枯病有較強(qiáng)抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌；何紅[9]，邱思鑫[10]等報道了內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillus sp.)對辣椒疫霉引起的辣椒苗和果疫病有良好的防治效果；阿里馬斯等[11]報道了放線菌對辣椒疫霉菌和炭疽病防治效果，但是關(guān)于內(nèi)生真菌用于茄科鏈格孢菌的生防研究未見報道。另外由于這些微生物主要源于土壤、果蔬表面，易受外界因素的影響，導(dǎo)致防治效果不穩(wěn)定，極大地影響了拮抗菌的實用價值。因此植物內(nèi)生菌的活性物質(zhì)的提取及其環(huán)境穩(wěn)定性的研究在生物防治和果蔬采后處理已成為研究的熱點。本試驗從湖南省長沙縣果蔬中心采集的柿子椒中篩選到了鏈格孢菌的拮抗真菌，通過16SrDNA序列分析對該菌株進(jìn)行了鑒定，為黏質(zhì)酵母菌。用乙酸乙酯和無水乙醇對黏質(zhì)酵母菌發(fā)酵液抗菌物質(zhì)進(jìn)行提取，并進(jìn)行活性穩(wěn)定性測試和防腐應(yīng)用研究，以期為食品防腐尋求新的技術(shù)途徑，使內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物成為果蔬采后微生物抑制劑和作為天然殺菌劑具有廣泛應(yīng)用前景和開發(fā)潛能。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

Strain-39菌：由本實驗室從柿子椒果肉中分離得到；

鏈格孢菌：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗中心提供。

1.2 Strain-39分子鑒定

參照文獻(xiàn)[12]、[13]進(jìn)行16SrDNA分子鑒定，PCR產(chǎn)物直接測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。得到的序列運用Clust X軟件校準(zhǔn)排齊后，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）同源性比對分析。以16SrDNA的序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類。然后在對待測菌株與模式菌株16SrDNA序列利用程序MEGA3.1中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定[14]。

1.3 拮抗菌strain-39的抑病活性檢測

辣椒和番茄用自來水反復(fù)清洗干凈，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1～2min，然后用自來水沖洗掉殘余次氯酸鈉，晾干。用滅過菌的打孔器在番茄和辣椒各部位打一個直徑6mm深2 mm的洞，接種拮抗菌strain-39約106CFU/mL的培養(yǎng)濾液20μL，靜止5 min后，接種病原菌鏈格孢菌約106CFU/mL的菌液20μL，以不接種病原菌和接種病原菌的未浸泡拮抗菌的辣椒和番茄作為對照，28℃培養(yǎng)72 h，觀察果蔬是否出現(xiàn)病斑及感病的程度。

1.4 Strain-39菌液成分對鏈格孢菌抑菌測定方法

在PDA平板中心接直徑為5mm的鏈格孢菌菌餅，28℃培養(yǎng)3 d后，在離菌落邊緣2.5 cm處用口徑9mm的打孔器打4個孔，每孔分別加入200μL經(jīng)過處理菌液成分，以無菌水作為空白對照，待對照病原菌菌落長到孔邊緣(6～7 d)后測量抑菌圈直徑。

(1)抑制率的計算：

(2)Strain-39菌液濾液制備的方法：將strain-39接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜作為種子液，按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中（裝液量100 mL/250 mL錐形瓶中），28℃，180 r/min培養(yǎng) 7 d，用 10 000 r/min離心 15 min，紗布雙層過濾去菌絲，用0.22μm的過濾頭過濾得到發(fā)酵液。

(3)乙酸乙酯提取物的制備：發(fā)酵液用乙酸乙酯（1倍體積）萃取3次，重復(fù)3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮置干，用磷酸緩沖液溶解得乙酸乙酯提取液。

(4)75%乙醇沉淀物的提?。簩o水乙醇置于冰箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)冷處理，在抑菌物質(zhì)粗提液中緩慢加入乙醇使其在終濃度達(dá)到75%，于4℃靜置4 h以上，10 000 r/min，4℃離心20min，收集沉淀，即為粗提物，將所得蛋白溶于pH值為6.8的20mmol/L tris緩沖液中，所得沉淀即為75%乙醇沉淀粗提液。

1.5 菌液成分的抑菌機(jī)制

1.5.1 不同濃度菌液成分對鏈格孢菌抑菌效果 將strain-39菌液的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物按照半稀釋 法 配 成 一 系 列 質(zhì) 量 濃 度 梯 度（100，50，25，12.5，6.25mg/mL）的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物，75%乙醇沉淀粗提液用pH為6.8的20mmol/L tris緩沖液稀釋，乙酸乙酯提取物用磷酸緩沖液稀釋，在PDA平板中心接直徑為5mm的鏈格孢菌餅，25℃培養(yǎng)2～3 d后，在離菌落邊緣2.5 cm處用口徑9mm的打孔器打4個孔，每孔加200μL菌液成分，以無菌水作為空白對照，待對照快要長滿全皿時，測量抑菌直徑，3次重復(fù)，計算毒理回歸方程、EC50值和95%置信區(qū)。

1.5.2 Strain-39菌液成分對果實病害的抑菌作用 菌液乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物分別用緩沖液稀釋到100mg/mL待用選取外觀整齊、飽滿圓潤、無損傷的新鮮辣椒和番茄，用自來水清洗后在0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒3min，再用自來水反復(fù)沖洗至殘余次氯酸鈉洗掉，晾干。用無菌的打孔器在番茄和辣椒的部位各打一個直徑6 mm深2mm的洞，注入20μL菌液成分，靜置2 h后，立即在傷口處加入20μL鏈格孢菌孢子懸浮液，以保鮮液和無菌水作為對照。用保鮮袋密封，以保持濕度，將蔬菜置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)貯藏，7 d后計算爛果率，每個處理分3組。每組隨機(jī)挑選60個果實，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5.3 Strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌菌絲形態(tài)影響 鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h活化，移接菌蝶5片于濃度為10%的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液中，以加相同量的不含菌的培養(yǎng)基為空白對照，培養(yǎng)48 h后在光學(xué)顯微鏡觀察病原菌菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.4 75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響 將鏈格孢菌接種在PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)10 d，然后加入一定量的無菌磷酸鹽緩沖液沖洗斜面上的孢子，經(jīng)無菌紗布過濾除去菌絲殘體，用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋至孢子濃度為106個/mL。每個視野60個孢子（10倍放大），取20μL滴加在凹玻片上，將凹玻片放在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)先放入10 mL無菌水，在無菌水上平放一張滅菌濾紙。再滴加20μL 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液?；靹蚝笾糜?8℃下培養(yǎng)12 h，以無菌水處理為對照，并按式(2)計算拮抗菌的抑制率，每處理3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.5.5 胞外蛋白以及乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響 鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，然后將菌蝶接種于PDA培養(yǎng)基中央，待菌落直徑達(dá)3 cm時，將周圍培養(yǎng)基挖出，將75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物分別用磷酸緩沖液稀釋2倍和10倍，分別取20mL淹沒真菌菌落20min，傾去緩沖稀釋液，每處理3次重復(fù)，以無菌水處理為空白對照，置于28℃下培養(yǎng)6 d，至孢子產(chǎn)生，每平板用10mL無菌磷酸鹽緩沖液將孢子洗下，經(jīng)4層紗布過濾，得孢子懸浮液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。

1.5.6 不同溫度處理對75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 將75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液2mL裝于試管中，在50，75，100℃條件下處理20min（恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行），121℃（高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行）處理20min，以未進(jìn)行溫度處理的各樣品作為對照，測定抑菌活性，每處理3個重復(fù)，試驗結(jié)果取平均值。

1.5.7 pH對75%乙醇沉淀提取液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 調(diào)節(jié)50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）的pH值分別為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，將 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物與不同的緩沖液等體積混合，置于4℃的冰箱內(nèi)保存24 h，再用2 mol/L的鹽酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至原菌液成分酸堿度（7.0左右），用0.45μm微孔濾膜過濾除菌。以鏈格孢菌為指示菌，測定抑菌活性，未經(jīng)過處理的各樣品作為對照，每處理3個重復(fù)，試驗結(jié)果取平均值。

1.5.8 紫外線處理對75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 取1 mL 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液置于60W紫外燈下30 cm照射1 h，以未經(jīng)處理的各樣品成分為對照，每處理3個重復(fù)，試驗結(jié)果取平均值。

1.5.9 數(shù)據(jù)分析 用SAS統(tǒng)計軟件對測定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05判斷差異有顯著性，P<0.01判斷差異極顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體和菌落特征

圖1 菌株strain-39的16SrDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR results of 16SrDNA sequences from the isolated srains-39

圖2 基于16SrDNA序列的菌株strain-39系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence analysis of strain-39

通過稀釋洗液涂布平板后可以形成單獨的菌落，這些內(nèi)生拮抗真菌的菌落形態(tài)相似，邊緣整齊，不著色，表面光滑，稍濕潤，無光澤，菌體橢圓形，橘紅色，取其中一個菌落，復(fù)紅簡單染色后，置普通光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體為革蘭氏陽性。提取菌株strain-39基因組DNA，以內(nèi)生菌株strain-39基因組DNA為模板，按1.2中的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），對PCR產(chǎn)物直接測序得到strain-39的16SrDNA長度為539 bp。利用Blast軟件，將菌株的16SrDNA序列與GenBank中數(shù)據(jù)庫已知的16SrDNA基因序列進(jìn)行比對，真菌strain-39的 16SrDNA 序列（539 bp）與（Uncultured basidiomycota genomic DNA）的序列相同。用軟件MEGA3.1按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）相似性都達(dá)到100%，結(jié)合strain-39形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化指標(biāo)測定等表型鑒定結(jié)果，strain-39菌株鑒定為黏質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。

2.2 拮抗菌strain-39的抑病活性檢測

由圖3可知，僅接種鏈格孢菌，不接種內(nèi)生菌的辣椒和番茄上出現(xiàn)明顯的鏈格孢菌病斑，而接種內(nèi)生菌的辣椒和番茄上，鏈格孢菌產(chǎn)生的病斑較小。說明菌株stain-39發(fā)酵液能夠較好的降低鏈格孢菌的致病力。

圖3 黏質(zhì)紅酵母strain-39對鏈格孢菌的抑菌活性試驗Figure 3 Detection of inhibitory activity of strain-39 against pathogen A.alternate

2.3 菌液75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌體外抑菌效果

對菌株strain-39 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液進(jìn)行抑菌活性測定，由圖4和表1可知，75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物稀釋不同濃度處理對鏈格孢菌都有較好的抑菌效果，strain-39菌液乙醇沉淀粗提液質(zhì)量濃度梯度為 100，50，25，12.5，6.25mg/mL 時對鏈格孢菌的抑制率分別為85.45%，80%，54.55%，43.64%，28.88%。乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度梯度為 100，50，25，12.5，6.25mg/mL 時對鏈格孢菌抑制率分別為 86.85%，81.97%，72.13%，45.90%，35.87%，其中75%乙醇沉淀提取液的EC50為16.353 1 mg/L，而乙酸乙酯提取物的EC50為11.800 3mg/L，后者抑菌效果較前者高。

2.4 Strain-39菌液成分對果實病害的抑菌作用

由圖5可知，通過損傷接種，strain-39的菌液成分對茄科植物辣椒和番茄果肉都具有明顯的抑菌作用，在一定質(zhì)量濃度下均能降低辣椒和番茄的爛果率，乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度為100 mg/mL時，辣椒的爛果率與無菌水相比下降了51.879%，番茄的爛果率與無菌水相比下降了58.47%，75%乙醇沉淀粗提液的腐爛率與無菌水相比辣椒的爛果率下降了47.5%，番茄的爛果率與無菌水相比下降了50.47%，不同菌液成分相比，乙酸乙酯提取物比75%乙醇沉淀粗提液的抑菌效果較好，與體外抑菌效果一致。與體外抑制作用效果相比，體內(nèi)抑制作用的效果顯然有所降低，但直接證明了strain-39抑菌成分對果實病害的抑制作用。

2.5 Strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響

圖4 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌抑菌效果Figure 4 Effecton A.alternata by 75%ethanol sediment liquid and ethyl acetate extract produced from strain-39

表1 菌株strain-39不同菌液成分對鏈格孢菌的抑制作用Table1 Inhibition effects of extraction from strain-39 against A.alternate

由圖6和7可知，strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對鏈格孢病菌菌絲的形態(tài)均有影響，將鏈格孢菌與strain-39 75%乙醇沉淀提取液和乙酸乙酯提取物在PDA平板上對峙培養(yǎng)6 d后，產(chǎn)生明顯的抑菌帶，靠近菌液成分邊緣處的病菌不能正常向外擴(kuò)展，而且此處菌絲變成褐色，說明其活性物質(zhì)可抑制鏈格孢菌的生長，調(diào)取邊緣菌絲在顯微鏡下觀察，活性成分邊緣的鏈格孢菌的菌絲頂端及中間形成大量泡狀體，以致整個菌絲變成串珠狀，菌絲體分枝增多、畸形。且乙酸乙酯提取物處理的部分菌絲呈現(xiàn)原生質(zhì)顆?；ＩL的菌絲成細(xì)長狀，且整個菌絲均勻透明。

2.6 Strain-39 75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，strain-39的75%乙醇沉淀粗提液處理后抑制鏈格孢菌分生孢子的萌發(fā)率為7.45%，而以無菌水處理的對照處理組分生孢子萌發(fā)率為75.36%；乙酸乙酯提取物處理過的孢子萌發(fā)率為9.6%，對照組為73.65%。由此說明，strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子的萌發(fā)都具有較好抑制作用。

圖5 Strain-39菌液成分對辣椒、番茄的抑制效果的影響Figure 5 Inhibitory effectof extraction from strain-39 on diseases of peppers and tomatoes

圖6 Strain-39 75%乙醇沉淀提取液處理鏈格孢菌菌絲的形態(tài)Figure 6 Effectonmorphology by 75%ethanol sediment liquid produced from strain-39

圖7 Strain-39乙酸乙酯提取物處理鏈格孢菌菌絲的形態(tài)Figure 7 Effectonmorphology by ethyl acetate extract produced from strain-39

表2 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提物和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響Table2 Effecton germination of conidiospore of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39

2.7 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響

將PDA培養(yǎng)基中生長至3 cm的鏈格孢菌菌塊分別加入稀釋2倍、10倍濃度的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液20mL，浸沒菌落20min后去除液體，以無菌水為對照，每個處理3次重復(fù)，6 d后計算孢子萌發(fā)率，結(jié)果見表3。不同稀釋倍數(shù)的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液均對鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生顯著性抑制作用，隨其稀釋倍數(shù)的增加，抑制作用也逐漸減弱，與對照相比，75%乙醇沉淀粗提液稀釋2倍鏈格孢菌孢子數(shù)為0.106×106個，其抑制率達(dá)到84.7%，稀釋10倍其孢子數(shù)為0.253×106個，孢子抑制率達(dá)到63.49%。而乙酸乙酯提取物稀釋2倍對孢子抑菌率為66.42%，稀釋10倍抑制率為71.87%，說明strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物可較好地抑制鏈格孢菌的產(chǎn)孢。

表3 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響Table3 Effect on production of conidium of A.alternata by 75%ethanol sediment and ethyl acetate extract produced from strain-39（/×106 CELLS·mL-1）

表3 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響Table3 Effect on production of conidium of A.alternata by 75%ethanol sediment and ethyl acetate extract produced from strain-39（/×106 CELLS·mL-1）

同列不同行大寫字母不同代表差異顯著，P<0.05。

提取液稀釋倍數(shù)2 10 CK乙酸乙酯提取物0.346B 0.413B 1.230A 75%乙醇沉淀提取液0.106A 0.253B 0.693B

2.8 不同溫度處理對strain-39 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物液抑菌活性的影響

表4 不同溫度處理下strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌生長的影響Table4 Effecton growth of of A.alternate by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different temperature

表4 不同溫度處理下strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌生長的影響Table4 Effecton growth of of A.alternate by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different temperature

同列不同行大寫字母不相同代表差異顯著，P<0.05。

溫度/℃75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑制率/% 菌落直徑/mm 抑制率/%50 75 100 121 CK 47.65±1.09A 45.36±2.33A 47.42±1.98A 18.56±1.63B—20.4 20.2 22.27 25 35.13 40.35±1.81A 42.52±1.08A 35.94±2.84B 28.92±1.23C—17.77 18.53 17.83 27.63 33.93

取strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物，不同溫度處理后測定其抑制率。由表4可知，75%乙醇沉淀粗提液在50℃和120℃，隨著溫度的增加抑菌活性逐漸降低（P<0.05），乙酸乙酯提取物在50～100℃時無顯著性差異（P<0.05），在121℃時，抑菌效果明顯降低（P<0.05）。兩者活性成分在不同溫度處理下抑菌活性不同，說明Strain-39中抑菌活性物質(zhì)可能含有幾種，且總體抑菌效果受溫度影響不大。即使120℃高溫處理下，菌液成分仍保持部分抑菌活性。

2.9 pH對strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌活性影響

由表5可知，pH在2～12對不同成分均有抑菌活性，strain-39的75%乙醇沉淀提取液最適pH為4～6，且抑菌活性達(dá)到52.66%，抑菌活性隨著pH的增加而增加，無顯著性差異（P<0.05），說明pH在酸性條件下活性比較穩(wěn)定，在堿性條件下隨著pH的增加活性逐漸降低，pH 12時活性顯著性降低（P<0.05），而乙酸乙酯提取物最適pH為6～8，在 pH 6時，抑菌活性達(dá)到38.97%，與75%乙醇沉淀提取物處理液相比，活性較穩(wěn)定。在pH 2和pH 10條件下，仍具有活性。說明菌液成分活性物質(zhì)具有較高酸堿穩(wěn)定性。

表5 不同pH處理下strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌生長的影響Table5 Effect on the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different pH

表5 不同pH處理下strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌生長的影響Table5 Effect on the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different pH

同列不同行大寫字母不同代表差異顯著，P<0.05。

pH 75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑制率% 菌落直徑/mm 抑制率/%2 4 6 8 1 0 12 CK 27.74±2.39C 21.59±1.48C 38.97±4.81A 31.12±3.24B 31.48±0.74B 21.41±3.60C—20.87 16.70 15.57 22.03 26.46 30.07 32.90 36.44±3.59A 49.14±2.68A 52.66±1.93A 33.01±1.58B 19.41±4.07C 8.53±1.98D—24.93 27.06 21.03 23.80 23.67 27.13 34.53

2.10 紫外線處理對strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響

表6 Strain-3975%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物在紫外處理下對鏈格孢菌生長的影響Table6 Effecton the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under UV

同列不同行大寫字母不同代表差異顯著，P<0.05。

紫外處理/min 75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑菌率% 菌落直徑/mm 抑制率/%30 60 90 CK 20.23 23.23 24.77 37.07 45.32±4.35A 37.25±2.75B 33.23±2.06B—23.87 28.54 31.7 37.7 41.02±6.35A 24.32±1.49B 15.89±1.44B—

由表6可知，在紫外照射下菌液不同成分都具有一定的抑菌活性，在紫外下照射30min，strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌效果最高，隨著紫外照射的時間延長乙酸乙酯提取物的抑菌活性顯著性降低（P<0.05），在90min時抑菌效果最弱，而75%乙醇沉淀提取物在處理90min后抑菌活性無顯著變化。整體來說不同菌液成分經(jīng)紫外處理后仍保持一定的抑菌活性。

3 討論

本試驗從新鮮辣椒果肉內(nèi)篩選出一株對茄科鏈格孢菌具有抑菌效果的內(nèi)生拮抗菌，通過16SrDNA鑒定為黏質(zhì)紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa），該菌株能夠明顯降低鏈格孢菌的致病力，具有成為果蔬采后鏈格孢菌抑制劑和作為天然殺菌劑的廣泛應(yīng)用前景。

對該菌株的菌液成分75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物抑菌活性進(jìn)行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物均具有良好的抗菌活性。strain-39在鏈格孢菌菌絲生長和發(fā)育、孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)等都具有抑制作用，表明拮抗菌strain-39有效抑制了鏈格孢菌的生長、繁殖等各個環(huán)節(jié)，且對鏈格孢菌侵染循環(huán)的抑制是各個環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景。

防腐保鮮試驗結(jié)果顯示strain-39菌液成分對抵御病原真菌的侵入，減少腐爛率，在防腐保鮮方面起到了重要作用，鏈格孢菌是茄科植物常見的病原菌，因此考慮將其替代化學(xué)殺菌劑用于果蔬采后保鮮方面，有望為食品防腐尋求新的技術(shù)途徑。

Strain-39分泌的抗菌物質(zhì)主要為低分子量抗菌素和胞外蛋白[14，15]。菌株strain-39 75%沉淀提取物在高溫處理后對鏈格孢菌抑制效果逐漸降低，但不是很明顯，是否為抑菌蛋白有待進(jìn)一步研究。而乙酸乙酯提取物在121℃時抑菌活性明顯下降，說明strain-39對鏈格孢菌的抑菌作用是為多種活性物質(zhì)作用的共同結(jié)果，后期還將進(jìn)一步分離純化strain-39菌株代謝物的抑菌活性成分，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，進(jìn)而對所分離出的各組分的抑菌活性和相互作用做更深入的研究。

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