趙建芬，李妍，董基，黃清華

（肇慶學院化學化工學院，廣東肇慶526061）

落葵（Basella rubra L.）又稱木耳菜、胭脂菜、紫藤菜、籬笆菜等，原產于亞洲南部地區(qū)，是一類生長迅速、適應性廣、容易栽培的藥菜兼用植物，我國各地均可種植[1]。落葵除含豐富的營養(yǎng)成分外，還含有皂甙、葡聚糖、黏多糖等藥用成分[2]。落葵全株可入藥，種子和葉片入中藥味甘。成熟落葵果實為紫紅色，含有甜菜花青素[3]和糖類物質。目前國內外的研究報道中鮮有從落葵果實中分離多糖的報道。多糖（Polysaccharide）是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚糖，是構成生命體的四大基本物質之一。當前的研究表明活性多糖與增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和降血脂等密切相關[3]。因此，對落葵果實多糖的提取將為其藥理活性的研究打下基礎，并有助于多糖資源的開發(fā)和利用。本工作采用超聲法、索氏法和水提法3種方法提取落葵果實多糖，苯酚-硫酸比色法測定其含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

新鮮紅花落葵果實：采自高要市蓮塘農家菜園。

1.1.2 儀器、試劑

S22/S22PC可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；RE-5299旋轉蒸發(fā)器：河南鞏義市宇翔儀器有限公司；超聲波清洗器SB25-12D：寧波新芝生物科技有限股份公司；索氏提取器：購自肇慶順達有限公司；BS210S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。鋁片、無水碳酸鈉、活性炭，葡萄糖對照品、濃硫酸、石油醚、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇等均為分析純，苯酚為化學純，藥品均購自天津市廣成化學試劑有限公司。

1.1.3 溶液的配置

1.1.3.1 5%苯酚試劑的制備

稱取苯酚50 g于100 mL燒瓶中，加入0.05 g鋁片和0.025 g碳酸氫鈉，蒸餾。收取182℃餾分。然后稱取純苯酚固體7.5 g，加水溶解并定容至150 mL，置棕色瓶內放冰箱備用。

1.1.3.2 葡萄糖標準溶液的配置

稱取105℃干燥恒重的葡萄糖0.025 0 g，加水溶解并定容至250 mL，配成濃度為100.0 μg/mL葡萄糖標準溶液，放冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

精密量取葡萄糖標準溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL置干燥試管中，分別加水至1.00 mL，加入5%苯酚溶液1.50 mL，濃硫酸7.50 mL，搖勻。室溫放置25 min，以不加葡萄糖標液的試劑空白為參比，在490 nm[4]處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，葡萄糖濃度C（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，建立線性回歸方程。

1.2.2 落葵果實多糖精制品的制備[4－5]

將新鮮的落葵果實清洗干凈，于烘箱中60℃恒溫干燥2 d，然后粉碎成粉末，密封備用。

稱取落葵果實粉末50 g，用250 mL石油醚于60℃～80℃的水浴中回流脫脂2次，每次1 h。再用250 mL 80%乙醇于80℃～90℃的水浴中回流提取2次，每次2 h，除去單糖、雙糖、低聚糖、皂苷類和多酚類等物質。殘渣加水250 mL，90℃水浴中提取2次，每次2 h。合并兩次水提取液，50℃減壓濃縮至75 mL，加2 g～3 g活性炭進行脫色。經兩次脫色后，濾液加5倍量95%乙醇，放置過夜，抽濾。抽濾后的沉淀加適量水溶解，采用Sevag法[6]脫去蛋白質，即按溶液1/5體積加入氯仿－正丁醇（預先配制成體積比為4∶1混合液），劇烈振搖20 min，靜置分層，棄去水層與有機層交界處的變性蛋白，重復一次。取水相，50℃減壓濃縮至適當體積，加5倍量95%乙醇沉淀，沉淀再分別以95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，60℃干燥，即得純度較高的白色落葵果實多糖。

1.2.3 落葵果實多糖換算因素的測定[4－5]

精確稱取60℃干燥恒重的多糖精制品0.035 0 g，水溶解后定容至100 mL，為多糖精制品儲備液。精確量取多糖精制品儲備液0.20 mL加水至1.00 mL，按測定標準葡萄糖溶液的方法測其吸光度，代人回歸方程，算出多糖溶液中葡萄糖的濃度C，從而計算換算因素：

式中：W為多糖質量，μg；C為多糖溶液中葡萄糖的濃度，（μg/mL）；D為多糖的稀釋體積mL。

1.2.4 超聲法、索氏法和水提法提取落葵果實多糖及其含量的測定

稱取落葵果實粉末9份，每份約0.2 g，按下列步驟進行多糖的提?。孩偃?份樣品，分別加入100 mL 80%乙醇，于45 kHz超聲提取40 min，傾去上清液，再加100 mL 80%乙醇重復提取一次，以除去單糖、雙糖和低聚糖。然后減壓抽濾。殘渣揮去乙醇溶劑后，加100 mL水，于45 kHz超聲提取40 min，再加水重復超聲提取一次。合并兩次水提取液，反復洗至250 mL容量瓶中，定容，作為超聲提取法的樣品液。②取3份樣品，分別用20 mL 80%乙醇浸泡過夜。再于索氏提取器中用80 mL 80%乙醇回流2 h，殘渣揮去乙醇溶劑后繼續(xù)用水回流提取2 h。用水反復洗至250 mL容量瓶中，定容，成為索氏提取法的樣品液。③取3份樣品，分別用100 mL石油醚70℃水浴提取2次，每次1 h，以除去油脂。去除石油醚溶劑后，分別用100 mL 80%的乙醇于80℃的水浴中提取2次，每次1 h，以除去單糖和低聚糖。再將殘渣用100 mL水于90℃的水浴中提取2次，每次1 h。合并兩次水提取液并定容為250 mL，成為水提取法的樣品液。

分別精確吸取樣品液1.00 mL，按測定標葡萄糖溶液的方法測其吸光度，根據回歸方程計算濃度C，按下式分別計算多糖含量：

式中：C為樣品溶液的葡萄糖濃度，（μg/mL）；D為樣品溶液的稀釋體積，mL；f為落葵果實多糖換算因素；W為樣品的質量，μg。

1.2.5 超聲法提取多糖重現性和回收率的測定

精密吸取同一超聲樣品提取液0.50 mL（5份），分別精密加入多糖精制品儲備液0.50 mL，按測定標準葡萄糖溶液方法測其吸光度，檢驗方法的重現性。

精密吸取同一超聲樣品提取液0.50 mL（5份），分別精密加入葡萄糖標準溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，按測定標準葡萄糖溶液方法測其吸光度，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

根據葡萄糖標準溶液的溶度和測得的吸光值，繪制葡萄糖標準曲線，如圖1所示?；貧w方程為A=0.065 2 C+0.000 2，R2=0.999 1，表明在 1.00 μg/mL ～7.00 μg/mL濃度范圍內，葡萄糖標準曲線線性關系良好，可用于樣品液的測定。

2.2 落葵果實多糖換算因素的測定

測得多糖精制品溶液的吸光度A=0.277，代人回歸方程，算得顯色反應液中葡萄糖濃度為4.258 μg/mL，則多糖液中葡萄糖的濃度C=4.258×10.0/0.20=212.9 μg/mL，計算換算因素：f=W/CD。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose solution

式中：W為多糖質量，μg；C為多糖液中葡萄糖的濃度，（μg/mL）；D 為多糖的稀釋體積，mL。

2.3 超聲法、索氏法和水提法提取落葵果實多糖及其含量的測定

對超聲法、索氏法和水提法提取的落葵果實多糖含量進行測定，計算結果如表1所示。

表1 3種方法提取落葵果實多糖的含量Table 1 Content of polysaccharide from the fruits of Basella extracted by three different methods

從表1可知，在考察的3種方法中，超聲法提取的多糖含量是索氏法的1.62倍，是水提法的2.65倍。而且超聲法提取時間短，無需加熱，大大提高了多糖的提取效率。由此，超聲提取多糖的方法優(yōu)于其他兩種方法。

2.4 超聲法提取多糖重現性和回收率的測定

超聲法提取落葵果實多糖重現性測定結果如表2所示，回收率測定結果如表3所示。

表2 重現性實驗結果（n=5）Table 2 Result of reproducible test（n=5）

如表2所示，RSD=1.24%，說明方法重現性良好，精密度高。

表3 回收率實驗結果Table 3 Result of recovery experiment

微量組分的回收率在95%～110%，認為方法可靠[7]。從表3可知，落葵果實多糖平均回收率高，在微量組分回收率要求的范圍內，且RSD值較小，由此可見，所建立的苯酚-硫酸比色法的準確度高、可靠性好。

3 結論

1）建立苯酚-硫酸比色法測定多糖的含量，回歸方程為 A=0.065 2C+0.000 2，R2=0.999 1，在 1.00 μg/mL～7.00 μg/mL濃度范圍內，葡萄糖標準曲線線性關系良好，而且方法可靠、重現性好，測定結果穩(wěn)定、準確度高，適用于落葵果實多糖的測定。

2）采用精制落葵果實多糖測得落葵果實多糖對葡萄糖的換算因子f=1.644。

3）不同的提取方法對落葵果實多糖的提取率不同，超聲法為6.240%，索氏法為3.854%，水提法為2.357%。三種方法中超聲法提取率最高，提取時間最短，無需加熱，所以超聲法提取落葵果實多糖的效率高于其他兩種方法。

[1] 陳連文,劉敬蘭,師建華.落葵色素的提取及其穩(wěn)定性的研究[J].化學世界,1995,49(11):581-583

[2] 盧毓星,岳森,盧隆杰.營養(yǎng)保健型蔬菜—落葵[J].特種經濟動植物,2006,9(2):30-31

[3] 彭會軍.落葵多糖的提取分離與藥理學研究[D].武漢：華中農業(yè)大學生命科學技術學院,2008:8-13

[4] 王自軍,鄧紅.白芥子多糖的超聲提取及含量測定[J].數理醫(yī)藥學雜志,2004,17(2):175-176

[5] 王文平,郭祀遠,李琳,等.苯酚-硫酸法測定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科學,2007,28(4):276-278

[6] 齊慧玲,魏紹云,王繼倫,等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究[J].天津化工,2000,13(3):20-21

[7] 華東理工大學,四川大學.分析化學[M].6版.北京：高等教育出版社,2009:12