劉愛潔 馮立科 李 理

LIU Ai-jie1 FENG Li-ke2 LI Li1

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510507）

(1.College of Light Industrial and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong 510640,China；2.Guangdong Yantang Dairy Corporation,Guangzhou,Guangdong 510507,China)

大豆酸奶作為一種新興的谷物酸奶，能充分利用中國大豆蛋白資源，同時(shí)可以優(yōu)勢互補(bǔ)的降低牛奶酸奶產(chǎn)品的脂肪、膽固醇含量，對于緩解中國乳源緊張局面、增強(qiáng)大豆蛋白質(zhì)的深加工利用以及提高國民的身體健康具有重要的意義。但因大豆球蛋白的三、四級結(jié)構(gòu)致密、硬度較大，使得大豆蛋白質(zhì)消化率和生物效價(jià)不高。用豆?jié){酶解液制得的酸豆奶不僅營養(yǎng)價(jià)值大大提高、發(fā)酵時(shí)間縮短、乳酸菌的產(chǎn)酸能力提高，同時(shí)其感官品質(zhì)也得以改善[1]。目前豆?jié){酶解多采用Alcalase蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味酶等工業(yè)用酶制劑，這些蛋白酶活性強(qiáng)，水解不易控制，易過度水解使豆?jié){變黃、產(chǎn)生咸味、堿味、苦味等[2]。大豆萌發(fā)不但可以增加活性異黃酮、維生素和膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)含量[3]，且種子內(nèi)部產(chǎn)生豐富的內(nèi)源蛋白酶，能對大豆蛋白亞基進(jìn)行一定程度的降解。本課題組的前期研究[4]表明大豆在浸泡12 h以后就顯示出較高的中性和酸性蛋白酶活性，其中中性蛋白酶活力為29.20 μg/(d·mg)，酸性蛋白酶活力為 8.57 μg/(d·mg)。大豆種子萌發(fā)過程中，利用大豆種子的內(nèi)源酶分解大豆本身的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等大分子營養(yǎng)物質(zhì)，可以改善大豆酸奶的綜合品質(zhì)[4,5]。本試驗(yàn)以不同萌發(fā)程度的大豆為原料，從內(nèi)源蛋白酶的降解作用出發(fā)，分析蛋白降解對豆?jié){和大豆發(fā)酵乳的品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆：當(dāng)季成熟的東北大豆；

脫脂乳粉：蛋白含量約32.7%，新西蘭Fonterra有限公司；

其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus LH-B02，LH-B02)：丹麥Chr.Hansen公司樣品；

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus IFFI 6038，S.T 6038)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus AS1.1482，L.B 1482)：廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

生化培養(yǎng)箱：PXY-190S-A型，廣東韶關(guān)科力儀器有限公司；

攪拌機(jī)：BE351B型，佛山順德美的集團(tuán)有限公司；

三恒電泳儀：ECP3000型，北京六一儀器廠；

雙板夾芯式垂直槽：DYCZ30型，廣州市叢源儀器有限公司；

手提式高壓滅菌鍋：YXQ-SG46-280S型，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HSG-IB-2型，常州奧華儀器有限公司；

電子天平：JJ500型，浙江余姚銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；

分光光度計(jì)：S22PC型，上海凌光技術(shù)有限公司；

流變儀：RS-600型，德國HAAKE公司；

pH計(jì)：S20型，瑞士梅特勒—托利多儀器有限公司；

超凈工作臺：SZX型，吳江凈化設(shè)備總廠；

激光共聚焦顯微鏡：TCSSP5型，德國萊卡儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萌發(fā)大豆酸奶的制備

(1)大豆酸奶制備工藝流程[6]：

大豆→挑選→消毒殺菌→浸泡→萌發(fā)→去皮→85℃熱水打漿→過濾豆?jié){→加糖、復(fù)原乳→滅菌→42℃發(fā)酵4 h→4℃冷藏24 h

(2)大豆籽粒萌發(fā)[6]：挑選均一、飽滿、無蟲蛀、表皮無破損霉變的完整大豆，沖洗去雜后用75%酒精滅菌1min，無菌水清洗6次，室溫?zé)o菌水中浸泡14 h，在培養(yǎng)盆中鋪布均勻后以4層紗布遮蓋，分別萌發(fā)至胚芽長度為0，1，3，5 cm。

(3)發(fā)酵劑和發(fā)酵底物的制備：配置12%的牛乳，經(jīng)115℃滅菌10min，按5%接種量（V/V）分別接入瑞士乳桿菌LH-B02、保加利亞乳桿菌L.B 1482和嗜熱鏈球菌S.T 6038，37℃靜止培養(yǎng)8～12 h。發(fā)酵劑經(jīng)數(shù)次活化后，參照文獻(xiàn)[7]的方法測定菌種活力，活力達(dá)到0.6時(shí)即可使用。

將不同芽長的大豆，去皮，用85℃熱水打漿(豆水比為1∶8，干豆)，180目篩過濾后制得豆?jié){。配置12%復(fù)原乳，豆?jié){和復(fù)原乳的比例為7∶3，添加8%的蔗糖，100℃滅菌15min，冷卻至室溫。

(4)接種：按5%的總接種量，在發(fā)酵底物中分別添加2%的瑞士干酪乳桿菌，1.5%的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，混勻分裝后42℃靜止發(fā)酵4 h，4℃后熟24 h。

1.2.2 萌發(fā)大豆豆?jié){的蛋白亞基及抗?fàn)I養(yǎng)因子變化

(1)萌發(fā)大豆豆?jié){中蛋白亞基組分含量變化：以不同芽長的大豆所制豆?jié){為待測樣品，于沸水中加熱5 min后，10 000 r/min離心10 min。參照Laemm li的電泳方法[8]，稍加改動。上樣量為15μL，分離膠、濃縮膠濃度分別為14%和4%，濃縮膠、分離膠電流分別為40，80mA。電泳完畢后以考馬斯亮藍(lán)R250將凝膠染色40min，脫色至透明后拍照。

(2)萌發(fā)大豆豆?jié){中胰蛋白酶抑制因子含量變化：將不同芽長的大豆所制豆?jié){取樣凍干，并在100℃下加熱不同時(shí)間，參照Kakade的方法[9]測定豆?jié){中胰蛋白酶抑制因子的活性，并依據(jù)GB/T 21498——2008(ISO 14902:2001,IDT)做稍許改動。

1.2.3 萌發(fā)大豆酸奶各項(xiàng)指標(biāo)變化

(1)萌發(fā)大豆酸奶pH、酸度及持水力的測定：用pH計(jì)測定樣品的pH值。按GB/T 5009.46——2010《乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》滴定酸度，以涅爾度°T為酸度指標(biāo)。

取30 g接種后的大豆酸奶，在離心管（32 mm×115 mm）中42℃發(fā)酵4 h，4℃冷藏24 h后將樣品在20℃條件下480×g離心10min，去除乳清后稱重。

式中：

Q——持水力，%；

W1——離心前樣品的質(zhì)量，g；

W2——離心后樣品的質(zhì)量，g。

(2)大豆酸奶流變特性的測定：將大豆酸奶順時(shí)針、逆時(shí)針各攪拌10次之后，用哈克流變儀測定酸奶流變性質(zhì)。選用40mm直徑的平板探頭，溫度控制在(25.0±0.5)℃，分析模式：頻率掃描，應(yīng)變?yōu)?.5%，頻率從0.1～10 Hz；剪切掃描，速率從0逐漸增加至500/s，然后再從500/s減小至0，每個(gè)步驟時(shí)間為180 s。每個(gè)測定重復(fù)2次[10]。

(3)萌發(fā)大豆酸奶的微觀結(jié)構(gòu)變化：大豆酸奶的微觀結(jié)構(gòu)應(yīng)用TCSSP5倒置顯微鏡（物鏡20×HC PL APO/0.70NA）觀察[11]。接種后的牛奶豆?jié){混合乳先用0.1%的Nile Blue再用0.01%的Nile Red染色。將接種染色后的混合乳樣品置于帶凹槽的載玻片中心，小心蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。在蓋玻片邊緣涂覆硅油以防止水分蒸發(fā)。制片完成后用錫紙包裹與酸奶樣品一起42℃發(fā)酵4 h。后熟24 h后將載玻片倒置在載物臺上，用100倍物鏡觀察。激發(fā)波長為488，633 nm，接收波長在稍大于相應(yīng)激發(fā)波長的范圍。為防止熒光淬滅，應(yīng)在盡短時(shí)間內(nèi)采集圖像。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行一維方差分析，置信區(qū)間為95%。

2 結(jié)果與討論

2.1 萌發(fā)大豆內(nèi)源酶對豆?jié){的影響

2.1.1 內(nèi)源酶對大豆蛋白的降解作用 大豆球蛋白（11S）和β-伴球蛋白（7S）是大豆中的主要儲存蛋白，占大豆總蛋白含量的70%以上。大豆在萌發(fā)過程中內(nèi)源酶對蛋白亞基的降解作用通過SDS-PAGE表現(xiàn)為圖1。豆?jié){中的脂肪氧化酶LOX的條帶在芽長3 cm的泳道開始變淺。LOX的降解有助于減緩豆腥味物質(zhì)的形成，幫助減少發(fā)酵豆乳的豆腥味。7S球蛋白的 α’，α 亞基及 11S 酸性亞基（A1、A2，A3，A4）在大豆萌發(fā)至3 cm時(shí)，電泳條帶開始變淡并產(chǎn)生新的或加深在其附近小分子條帶。除本課題組[4]前期測得的較高的中性和酸性蛋白酶活性外，也有相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在大豆萌發(fā)過程中，蛋白酶C1、一種新的絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶D3[12]等蛋白酶均能夠有效地降解β-伴球蛋白的α’及α亞基[10,11]。酸奶是典型的酸致蛋白凝膠，大豆蛋白的適度降解對大豆酸奶的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和理化特性改善有重要作用。

圖1 萌發(fā)大豆豆?jié){中蛋白亞基組成變化圖譜Figure 1 Degradation of soybean protein in the germinated soybeanmilk

2.1.2 內(nèi)源酶降解對豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑的影響 大豆胰蛋白酶抑制因子(soybean trypsin inhibitor，STI)是大豆主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，能引起胰腺增生和抑制動物生長，生大豆40%的抗?fàn)I養(yǎng)作用是STI引起的[12]。由圖2可知，內(nèi)源酶的降解作用可以顯著降低豆?jié){中胰蛋白酶抑制因子的活性并提高其熱敏感性。當(dāng)芽長為3 cm時(shí)，生豆?jié){中TIA降低了32%，而豆?jié){滅菌即100℃加熱15min后，芽長1 cm和3 cm的大豆豆?jié){TIA分別降低了48%和40%，而未經(jīng)萌發(fā)的大豆豆?jié){TIA只降低了30%。

圖2 萌發(fā)大豆豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑活性變化Figure 2 The trypsin inhibition activity(TIA)of the germinated soybeanmilk

2.2 萌發(fā)大豆內(nèi)源酶對大豆酸奶的影響

2.2.1 內(nèi)源酶降解對大豆酸奶pH、酸度和持水力的影響

內(nèi)源酶作用對大豆酸乳pH、酸度及持水力的影響見表1。萌發(fā)大豆酸奶的酸度隨芽長增長即內(nèi)源酶作用時(shí)間延長而顯著性增大，pH也隨芽長增長呈現(xiàn)降低的趨勢，這是因?yàn)榇蠖姑劝l(fā)過程中，其內(nèi)源蛋白酶限制性降解部分蛋白質(zhì)，釋放出大豆多肽和游離氨基酸[4]，同時(shí)產(chǎn)生還原糖和礦物質(zhì)等有利于縮短發(fā)酵劑的適應(yīng)期，加快乳酸菌的增殖產(chǎn)酸[13,14]，導(dǎo)致酸度上升、pH下降。凝固型酸奶的持水力是評價(jià)酸奶凝膠網(wǎng)絡(luò)體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一。如表1所示，后熟24 h后，芽長為0，1，3 cm的大豆所制酸奶持水力較高，均在90%以上，其中1 cm最大，芽長5 cm的大豆所制酸奶持水力最低（<90%），3 cm次之。低持水力主要是由于發(fā)酵酸乳不穩(wěn)定的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的[15]，當(dāng)大豆萌發(fā)至5 cm時(shí)，大豆蛋白亞基相對較多的被降解為肽鏈、多肽或氨基酸，導(dǎo)致蛋白凝膠中膠粒連接減弱，不能很好地將水分包裹在它的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)，所以5 cm樣品酸奶凝膠顯示出較低的持水力。

表1 萌發(fā)大豆酸奶的pH、酸度和持水力覮Table1 pH,acidity and water-holding capacity of germinated soy yogurt(n=3)

2.2.2 內(nèi)源酶降解對大豆酸奶流變性質(zhì)的影響

(1)頻率掃描：應(yīng)用線性黏彈性理論，研究萌發(fā)的即經(jīng)內(nèi)源酶作用的大豆酸奶在小變形范圍內(nèi)的黏彈性質(zhì)及變化規(guī)律。不同芽長的大豆酸奶樣品的頻率掃描結(jié)果見圖3。G'是在振動測試中每一個(gè)變形周期內(nèi)的儲能模量，它可以表征酸奶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度，代表酸奶的彈性；G''是酸奶在變形過程中所損失的能量，代表酸奶的黏性。在0.1至10 Hz的線性黏彈性范圍內(nèi)，大豆酸奶樣品的G'和G''顯示出較強(qiáng)的頻率敏感性，數(shù)值均隨掃描頻率增加而增大，且G'值均高于G''值，表現(xiàn)出類固體的流變特性[16]。大豆經(jīng)過萌發(fā)后，大豆酸奶的G'及G"值均顯著下降，且隨著樣品芽長增加，下降趨勢更明顯。有研究[17]表明，G'數(shù)值的降低，凝膠結(jié)構(gòu)表現(xiàn)得越為疏松。由此可見，內(nèi)源酶的作用可顯著降低大豆酸奶的黏彈性，即是說大豆酸奶凝膠的抗壓抗震能力減弱且黏度降低。這應(yīng)該是萌發(fā)過程中，大豆內(nèi)源酶的酶解作用使大分子蛋白部分降解，同時(shí)將結(jié)構(gòu)致密的大豆球蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松，進(jìn)而使萌發(fā)大豆制成的大豆酸奶凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加疏松柔軟，膠束之間的纏黏能力減弱導(dǎo)致的。

(2)剪切掃描：采用Herschel-Bulkley模型對萌發(fā)大豆酸奶的剪切速率與剪切應(yīng)力曲線進(jìn)行擬合分析（表2）。該模型可由式(2)來表示。

式中：

τ——剪切應(yīng)力，Pa；

τ0——屈服應(yīng)力，Pa；

圖3 萌發(fā)大豆酸奶的頻率掃描曲線Figure 3 Frequency sweeps of germinated soy yogurt

γ——剪切速率，1/s；

к——稠度系數(shù)，Pa·sn；

n——流動行為指數(shù)。

如表2所示，所有樣品的R2均高于0.95，表明Herschel-Bulkley模型適合用于大豆酸奶剪切掃描曲線的擬合分析；n值均小于1表明4種發(fā)酵酸乳均為非牛頓流體—假塑性流體[18]。大豆萌發(fā)后，發(fā)酵豆乳的屈服應(yīng)力顯著下降，分別從0 cm樣品中的8.08 Pa下降至5 cm樣品中的2.90 Pa。Harte等[19]研究表明，酸奶的屈服應(yīng)力數(shù)值與感官品評中的“硬度”有密切關(guān)系，即與未萌發(fā)大豆酸奶相比萌發(fā)大豆酸奶的口感表現(xiàn)更為柔軟。大豆經(jīng)過萌發(fā)后，大豆酸奶的流動行為指數(shù)n值增大，稠度系數(shù)κ表觀黏度降低，這與頻率掃描樣品黏彈性降低的結(jié)果一致。觸變性是流體受到剪切時(shí)，稠度變小，停止剪切時(shí)，稠度又增加，即一觸即變的性質(zhì)。觸變性流體的機(jī)理可以理解為隨著剪切應(yīng)力的增加，粒子間結(jié)合的結(jié)構(gòu)受到破壞，黏度降低；當(dāng)作用力停止時(shí)粒子間結(jié)合的構(gòu)造逐漸恢復(fù)原樣，但需要一段時(shí)間[20]。因此，剪切速率減少時(shí)的曲線與增加時(shí)的曲線不重疊，形成了與流動時(shí)間有關(guān)的滯后曲線（流變環(huán)）。隨芽長增長，0，1，3 cm的酸奶樣品觸變性依次顯著性增大，表明在同樣的剪切作用下芽長越長的酸奶樣品質(zhì)構(gòu)破壞的越徹底，所以萌發(fā)可使大豆酸奶口感變得柔軟爽滑。至于5 cm的酸奶樣品觸變性最小應(yīng)該是大豆內(nèi)源蛋白酶把太多的大豆蛋白降解為較小分子[21]，使酸奶的凝膠結(jié)構(gòu)變得非常脆弱，在剪切初期結(jié)構(gòu)就被破壞且蛋白膠束間交聯(lián)比較困難，結(jié)構(gòu)很難恢復(fù)的原因。

表2 萌發(fā)大豆酸奶的流變參數(shù)覮Table2 Rheological parameters of germinated soy yogurt(n=2)

圖4 內(nèi)源酶降解對大豆酸奶微觀結(jié)構(gòu)的影響Figure 4 Effectof Endogenous enzyme enzymolysis on themicrostructure of sogurt

(3)內(nèi)源酶降解對大豆酸奶微觀結(jié)構(gòu)的影響：激光共聚焦顯微鏡（CLSM）經(jīng)常用于乳液及凝膠的微觀結(jié)構(gòu)研究。圖4為不同芽長的萌發(fā)大豆酸奶樣品的微觀結(jié)構(gòu)圖，本組圖片中蛋白顯現(xiàn)紅色，油脂顯現(xiàn)綠色。從圖4中可以看到明顯的絮狀凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。酸奶凝膠的微觀結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了其持水力、質(zhì)構(gòu)、流變等特性。隨著萌發(fā)程度的增加，大豆酸奶三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的間隙顯著增大，結(jié)構(gòu)變得更為疏松。0，1 cm酸奶樣品網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，這是由于大豆蛋白的分子結(jié)構(gòu)較致密，分子剛性較強(qiáng)，因此所形成的蛋白凝膠結(jié)構(gòu)非常緊密而剛硬，因此顯示出很高的硬度、黏附性及黏彈性流變特性[22]，這與流變數(shù)據(jù)吻合；它們較高的持水力也可以用致密的凝膠結(jié)構(gòu)來解釋。大豆芽長越長，其內(nèi)源酶降解作用越強(qiáng)。內(nèi)肽酶能將大豆蛋白降解為長短不一的多肽鏈，使大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)變得疏松，從而改善大豆酸奶中的蛋白膠束交叉連接情況，使交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的羥基、羧基等親水基團(tuán)更多地暴露出來，親和更多水分子進(jìn)入大豆蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)體系[23]，使凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更為疏松柔軟，這與3，5 cm酸奶樣品具有較低的屈服應(yīng)力τ0也相對應(yīng)。此外，當(dāng)芽長為5 cm時(shí)，大豆內(nèi)蛋白被過度降解，蛋白分枝減少，生成的蛋白鏈末端親水基團(tuán)較多，使大豆酸奶中大豆蛋白的交聯(lián)作用變?nèi)?，產(chǎn)生大的間隙孔洞，凝膠體系變得脆弱易破壞，結(jié)構(gòu)不易恢復(fù)，使凝膠的持水力降低。

3 結(jié)論

(1)SDS-PAGE電泳分析不同芽長的大豆豆?jié){中蛋白質(zhì)亞基組成的變化情況表明：萌發(fā)過程中，在內(nèi)源蛋白酶作用下，大分子量蛋白隨芽長增長而逐漸被降解產(chǎn)生小分子的蛋白。大豆在芽長為3 cm時(shí)，β-伴球蛋白（7S）的α'、α亞基及大豆球蛋白（11S）酸性亞基開始被降解；對大豆胰蛋白酶抑制因子活性的分析結(jié)果表明：內(nèi)源酶的降解降低了豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑的活性，提高了其熱敏感性，提高了豆?jié){或大豆酸奶的安全性和營養(yǎng)性。

(2)大豆萌發(fā)能顯著提高大豆酸奶的酸度、降低pH，并影響酸奶的持水力；CLSM微觀圖像和流變特性分析表明大豆萌發(fā)可使大豆酸奶凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得細(xì)膩，顯著降低大豆酸奶的屈服應(yīng)力和表觀黏度，對大豆酸奶的質(zhì)構(gòu)有很好的改善作用。

(3)試驗(yàn)表明芽長為3 cm時(shí)，大豆酸奶的胰蛋白酶抑制劑活性最低，理化特性、流變特性最好，微觀結(jié)構(gòu)細(xì)膩，綜合品質(zhì)最好。

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