李澤鍵　賴仁發(fā)

目前，臨床上對于骨移植材料的需求量日益增加，各種類型的骨移植材料已經(jīng)在實驗研究中取得了一定的成效并逐漸進入臨床應用研究階段，評價骨移植材料成骨效能的指標也愈來愈多樣化，各項指標之間各有側(cè)重，從不同的角度反映材料的骨修復能力。本文通過檢索近幾年的相關研究文章，對各項評價骨材料成骨效能的檢測指標及其對應的檢測方法做了如下總結(jié)。本文將成骨效能的檢測指標歸納為新骨形成，微血管形成，成骨活性標志物的表達，骨組織形態(tài)及生物強度檢測等幾個方面，根據(jù)檢測指標的需要，對各種特異性檢測方法也作了總結(jié)，現(xiàn)綜述如下。

1 新骨形成與骨組織形態(tài)的檢測

1.1 影像學檢測：X-ray是最常見，也是最原始的檢測方法，早在1896年便開始應用于醫(yī)學影像，是目前醫(yī)學診斷的重要手段之一。目前，研究者在使用X-ray的同時，多采用一些定量或半定量的評分標準，對X-ray顯像結(jié)果進行定量分析、比較。竇洪磊等[1]應用X-ray結(jié)合Lane-Sandhu評分系統(tǒng)對同種異體骨移植修復大段骨缺損療效進行檢測，將X-ray顯像結(jié)果通過計分轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)值進行統(tǒng)計分析與比較。Mahesh等[2]采用X-ray結(jié)合Kuznetsov半定量評分標準檢測人類骨髓間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)成骨情況，同樣將X-ray檢測結(jié)果轉(zhuǎn)化為計分，利用統(tǒng)計學方法進行分析比較。

螺旋CT三維重建在骨缺損修復療效的檢測方面目前應用較多，利用多層螺旋CT進行圖像分析和骨密度測定可以更直觀地了解骨組織缺損重建后局部組織再礦化的程度。國內(nèi)外學者已應用定量CT進行三位的骨密度測量，并取得了一定成果[3-4]。多層螺旋CT 技術(shù)能將骨皮質(zhì)和骨松質(zhì)的圖像顯示得更加清晰，通過調(diào)整圖像能使人眼更易觀察到細微的灰度變化，以便更加精確和全面地對冠狀位、矢狀位和橫斷面的三維CT圖像進行測量，準確反映局部骨密度變化；螺旋CT圖像不僅可以通過不同灰階度顯示其密度的高低，還可用組織對X射線的吸收系數(shù)反映其密度高低的程度，即CT 值。Maki等[5]通過體外試驗顯示，CT值與羥基磷灰石濃度有較高的相關性。Norton等[6]及Shahlaie等[7]亦認為CT值用于對缺損區(qū)修復再造后骨密度的評價具有一定的價值，可以用CT測量值來預測骨密度。

CBCT是近幾年新發(fā)展的檢測技術(shù)，它具有一次掃描、三維成像，三維影像更加清晰，最小分辨率可達到0.125mm，并可以實時顯示橫縱斷面的三維影像，使得成骨效能的檢測更加全面、直觀、可靠。隨著CBCT在口腔醫(yī)學影像診斷學的發(fā)展應用，已有不少研究者將CBCT應用于頜面骨缺損修復效果的檢測。劉苗等[8]應用CBCT觀察人工骨對兔下頜骨缺損的修復效果，得到清晰的三維圖像，能夠多角度多層面地觀察下頜骨缺損修復后的成骨情況，提示CBCT作為骨效能檢測手段的可行性。Roe等[9]及Kim等[10]也應用CBCT評價骨缺損修復的效果，認為CBCT在骨檢測方面具有廣闊的應用前景。

1.2 組織形態(tài)學檢測：伊紅-蘇木素染色法 （hematoxylin-eosin staining），簡稱HE染色法，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一，科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。其原理是去氧核糖核酸（DNA）帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍色，粘液呈灰藍色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明對比。目前，HE染色不僅應用于骨組織標本的定性分析，也結(jié)合一些評分標準進行定量分析，如有學者采用HE染色結(jié)合Nibson骨缺損組織形態(tài)學評分標準對骨組織形態(tài)進行定量分析取得了不錯的效果[11-12]。

茜素紅染色（alizarin red S staining）同樣也是一種鈣結(jié)節(jié)的特異性染色方法，其原理是茜素紅能夠與鈣離子發(fā)生顯色反應，產(chǎn)生一種深紅色的鰲和物，用以識別組織細胞的鈣鹽成分，將沉積的鈣鹽結(jié)節(jié)染成深紅色，主要適用于動物原生代或培養(yǎng)細胞的鈣沉積和鈣化結(jié)節(jié)檢測。但它的缺點是容易受到其它金屬元素的干擾。目前，大量的國內(nèi)外學者對于培養(yǎng)細胞表明鈣鹽的沉積及新骨組織中鈣結(jié)節(jié)的檢測均傾向于采用茜素紅染色，充分體現(xiàn)其檢測的特異性及可靠性[13-16]。

1.3骨密度及骨礦化檢測：骨密度（bone mineral density， BMD），全稱“骨骼礦物質(zhì)密度”。影像學領域的骨密度是指單位骨體積或面積的平均骨礦物質(zhì)含量， 是反映骨質(zhì)量的重要指標。早期、精確地BMD檢測可以及時了解骨質(zhì)的變化。目前主要是使用骨密度儀對BMD進行檢測，通過測定人體骨礦并獲得各項相關數(shù)據(jù)，結(jié)果數(shù)據(jù)以T值為主，還包括Z值、骨密度、骨量等數(shù)據(jù)，目前市場上主流的骨密度儀分為雙能X射線骨密度儀和超聲骨密度儀兩大類，其中以雙能X線方式測試的結(jié)果較準確，是國際衛(wèi)生組織（WHO）采用的骨密度金標準。雙能X射線骨密度儀可測量全身任何部位的骨量，精確度高，對人體危害較小，測得的數(shù)據(jù)準確，已被國內(nèi)外學者廣泛應用于骨移植材料成骨效能的檢測。Gautam等[17]采用骨密度儀檢測復合骨移植材料的峰值骨量，測得新骨組織的礦化程度及新骨形成率、礦化率等指標，從而精確、定量地反映了移植材料的成骨效能。Chen等[18]采用雙能X射線骨密度儀檢測一種中藥提取物復合材料移植大鼠牙槽骨后的BMD，從而反映了實驗組相對于對照組明顯的成骨作用。此外，Xie等[19]采用了另外一種檢測方法—Micro-CT檢測骨組織的BMD，同樣證實了骨移植材料量化的成骨效能。

2 成骨活性標志物的表達檢測

2.1 堿性磷酸酶：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP） 是廣泛分布于人體骨骼組織的一種酶，它不是單一的酶，而是一組同功酶，目前已發(fā)現(xiàn)有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5與ALP6六種同功酶。ALP確切的生理作用目前仍不十分清楚，但它在骨組織中相當活躍，一般認為骨中ALP和骨的鈣化作用密切相關，成骨細胞中的ALP作用產(chǎn)生磷酸，與鈣生成磷酸鈣沉積于骨中。因此，檢測ALP的活性程度，可以反映成骨過程中的鈣鹽沉積情況。李曉峰等[13]利用堿性磷酸酶試劑盒檢測移植骨的ALP活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性細胞可見藍黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位。Chen等[18]，Li等[20]及Kim等[21]通過免疫印跡等方法檢測ALP的活性來評價骨移植材料的成骨效能。

2.2 骨鈣素/骨鈣蛋白：骨鈣素（bone gamma- carboxyglutamic-acid-containing proteins，BGP）又稱骨鈣蛋白（osteocalcin），該蛋白在骨礦化峰期之后才出現(xiàn)積聚，由成骨細胞合成并分泌，不受骨吸收因素的影響。通過檢測血清骨鈣素水平可以了解成骨細胞，特別是新形成的成骨細胞的活動狀態(tài)。骨鈣素值隨骨更新率的變化而不同，骨更新率越快，骨鈣素值越高，反之降低。Chen等[18]通過ELISA法檢測骨鈣蛋白的含量，從而評價骨移植材料在骨修復過程中的成骨效應。賈春蓉等[22]采用125I 放免法檢測細胞上清液中骨鈣素含量，從而評價研究對象的成骨活性。

3 骨組織生物學強度檢測

修復骨缺損不僅要恢復骨形態(tài)的連續(xù)，重要的是重建骨的支撐功能，這就要求骨移植材料的生物力學性能應盡可能達到正常骨皮質(zhì)的力學性能。李明等[11]于移植后16周對移植骨塊進行生物力學三點抗彎曲實驗載荷、彎曲應力檢測， 實驗組與實驗對照組新骨生成有顯著性差異，而與正常骨組織之間無顯著性差異。簡月奎等[23]對植入后24周的移植骨塊進行生物力學檢測，結(jié)果顯示移植骨塊的抗壓縮壓強及極限壓強、抗彎曲載荷及極限載荷、抗扭轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)矩及極限轉(zhuǎn)矩與自體骨組及正常骨組均基本相似。

4 小結(jié)與展望

隨著對各種組織工程骨移植材料的深入研究，對于各種檢測指標及方法的應用也逐漸成熟。但是，目前現(xiàn)有的檢測指標及檢測方法尚未形成一定的體系與標準，一些檢測指標的金標準尚未確定。另外，對骨材料移植后成骨效能的檢測仍較大程度地停留在離體組織的靜態(tài)檢測，對于活體成骨效能的動態(tài)檢測指標及方法仍有待進一步研發(fā)。

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[收稿日期]2012-12-01 [修回日期]2013-03-26

編輯/李陽利