張婉 李麗

摘 要：簡(jiǎn)述了SSR分子標(biāo)記的基本原理和特點(diǎn)，從白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、SRR指紋圖譜的構(gòu)建、雜交種純度的鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記在輔助育種上的應(yīng)用等幾個(gè)方面介紹了近年來(lái)白菜研究中SSR分子標(biāo)記的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：白菜；分子標(biāo)記；SSR；遺傳分析

引言

白菜（Brassica campestris L. ssp. Pekinensis）原產(chǎn)于我國(guó)北方，現(xiàn)廣泛種植于全國(guó)的標(biāo)志性蔬菜種類之一，分為結(jié)球白菜、不結(jié)球白菜兩個(gè)亞種。由于不同的白菜品種之間可以進(jìn)行天然的雜交，如隔離不當(dāng)以至于品種之間混淆，形成了很多栽培亞種或變種，且現(xiàn)今大量的白菜新品種涌入市場(chǎng)，因此，品種差異的鑒定在蔬菜生產(chǎn)和使用中顯得尤為重要。對(duì)于商用種子的品種鑒別，新品種登記測(cè)試以及資源種質(zhì)遺傳多樣性分析，都非常需要發(fā)展一種高效、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的品種鑒別方式[1]。近年來(lái)生化和分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展使得其在鑒別能力、速度及準(zhǔn)確性方面都比傳統(tǒng)的種植鑒別有明顯的優(yōu)勢(shì)，并且這些技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于茄子、黃瓜、玉米、水稻等蔬菜作物種質(zhì)資源的鑒定，指紋圖譜的構(gòu)建，分子標(biāo)記輔助選擇育種及雜交種純度的檢測(cè)。利用分子技術(shù)已經(jīng)在白菜的研究中進(jìn)行了遺傳多樣性的分析，SSR指紋圖譜的構(gòu)建，品種真實(shí)性的鑒定及純度的檢測(cè)等大量工作[2-4]。在新品種審定及新品種的品種權(quán)授予前需要進(jìn)行DUS測(cè)試，確定該品種的特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability） ，由于在各項(xiàng)研究中運(yùn)用了分子標(biāo)記技術(shù)，大大減少了實(shí)際中對(duì)于白菜種子檢測(cè)的工作量。

現(xiàn)階段在蔬菜研究中應(yīng)用較廣泛的DNA分子標(biāo)記主要包括擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性 （random amplified polymorphic DNA，RAPD）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ simple sequence repeats，SSR）。AFLP標(biāo)記技術(shù)是基于PCR擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，目前在甘藍(lán)、大白菜、番茄、馬鈴薯、黃瓜等蔬菜作物的品種純度鑒定上得以應(yīng)用，但由于其操作程序較復(fù)雜，成本較高，影響其在商業(yè)品種鑒定中的廣泛使用。RAPD技術(shù)自建立以來(lái)就在蔬菜研究中得到廣泛的應(yīng)用[5]，然而對(duì)于栽培品種之間真實(shí)性鑒別，其多態(tài)性頻率相對(duì)較低，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，影響其在品種鑒定中廣泛應(yīng)用。SRAP是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，最早是在蕓薹屬作物開(kāi)發(fā)出來(lái)。SSR分子標(biāo)記技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行SSR的多態(tài)性分析的方法已在植物中得到較廣泛的應(yīng)用。本文對(duì)于應(yīng)用較廣泛的SSR分子標(biāo)記技術(shù)在白菜品種鑒定中的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，為今后的白菜研究工作提供一定的參考。

1 SSR分子標(biāo)記的基本原理和特點(diǎn)

SSR也叫微衛(wèi)星DNA，一般由幾個(gè)核苷酸（2-5bp）序列簡(jiǎn)單串聯(lián)成重復(fù)序列，根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)得到的擴(kuò)增片段，從而來(lái)揭示其多態(tài)性。SSR具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)；（2）呈共顯性遺傳，可用來(lái)對(duì)雜交種進(jìn)行純度檢測(cè)；（3）實(shí)驗(yàn)所需DNA量較少，且操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠性高；（4）數(shù)量豐富，且均勻覆蓋整個(gè)染色體組。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析和品種鑒定上的優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)，重要的是可以選特定的染色體上特定位置的SSR標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源的鑒定和雜交種純度的檢測(cè)。

2 白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析

分子標(biāo)記在種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究中是一種有效的技術(shù)手段，目前，主要應(yīng)用在遺傳多樣性分析中的分子標(biāo)記技術(shù)有AFLP、ISSR和SSR標(biāo)記等[6-7]，其中SSR標(biāo)記以其豐富的多態(tài)性被廣泛應(yīng)用于蔬菜作物品種的遺傳多樣性的分析中。楊華[8]等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)17份甘藍(lán)、44份白菜，共61份蕓薹屬蔬菜進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，所有材料被分為甘藍(lán)和白菜兩大類，其中白菜類品種的遺傳相似系數(shù)在0.96～0.77之間，甘藍(lán)類品種相似系數(shù)在0.93～0.63之間。并且作者還通過(guò)SSR分子標(biāo)記技術(shù)與農(nóng)藝性狀鑒定相結(jié)合的方法來(lái)進(jìn)行蕓薹屬蔬菜的多樣性的分析，彌補(bǔ)了單一農(nóng)藝性狀鑒定上的不足之處，使之更加準(zhǔn)確可靠。另外，在ISSR標(biāo)記分析遺傳多樣性方面，杜黎明[9]等利用ISSR分子標(biāo)記法，用11個(gè)具有高多態(tài)性引物對(duì)65個(gè)白菜樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出107條譜帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)102個(gè)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性的分析，遺傳相似系數(shù)在0.40-0.65之間。聚類分析結(jié)果表明，能將65個(gè)白菜品種劃分為4大類，并表現(xiàn)出大部分種質(zhì)資源關(guān)系與其來(lái)源地有一定的相關(guān)性。張波[10]對(duì)不結(jié)球白菜晚抽薹分子標(biāo)記及抽萎性的遺傳多樣性進(jìn)行了分析研究，研究表明，利用的RAPD、SSR，ISSR、SRAP多種分子標(biāo)記手段進(jìn)行遺傳分析，最后僅從SSR引物中得到一條引物DBCl6與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7cM，其余分子標(biāo)記方式則均未發(fā)現(xiàn)與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。王笑一[11]等在用20對(duì)SSR引物建立80個(gè)小白菜品種的指紋圖譜的前提下，并對(duì)其進(jìn)行了遺傳特異性分析，聚類分析表明，87.50% 的品種具有遺傳特異性。

3 SSR指紋圖譜的構(gòu)建和雜交種純度的鑒定

現(xiàn)階段我國(guó)對(duì)于白菜種質(zhì)資源主要通過(guò)農(nóng)藝性狀和形態(tài)表型進(jìn)行鑒定的，由于鑒定周期較長(zhǎng)，性狀差異不明顯，且受環(huán)境影響較大，從而難以將不同種質(zhì)資源完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。品種間無(wú)論從形態(tài)、生理和生化上的區(qū)別，其實(shí)都是DNA水平上的差異，所以運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)是通過(guò)直接分析遺傳多態(tài)性從DNA水平上來(lái)鑒定品種間差異。SSR由于具有高多態(tài)性和可重復(fù)性，是應(yīng)用于蔬菜作物類品種間鑒定及雜交種純度的鑒定較廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一，李麗[1]等開(kāi)發(fā)了由3個(gè)引物對(duì)組成的6套EST-SSR復(fù)合標(biāo)記組合，并完成了43個(gè)白菜品種的鑒別和大白菜品種差異的檢測(cè)，驗(yàn)證了其EST-SSR復(fù)合標(biāo)記能代表白菜品種間的多態(tài)性、品種內(nèi)一致性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，并且可以高效準(zhǔn)確的對(duì)白菜和大白菜品種的真實(shí)性和雜交純度進(jìn)行鑒別。

白菜雜交種是由獨(dú)立的兩個(gè)自交系雜交組配形成的，這兩個(gè)自交系均可獨(dú)立地與其他許多自交系組配，對(duì)于有些優(yōu)良的自交系，其使用頻率極高，所以造成大量品種都是同父異母或同母異父，其品種間的特異性鑒定更加困難。相比傳統(tǒng)的品種鑒定技術(shù)，SSR分子指紋技術(shù)是對(duì)新品種審定和檢測(cè)品種唯一性、一致性及穩(wěn)定性的一種較有效的分子技術(shù)方法。雖然不能僅用其作為直接判定品種具有特異性的依據(jù)，但可以通過(guò)分子技術(shù)形成的品種SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)信息篩查出與之近似的品種，然后將新申請(qǐng)的品種與近似品種田間并排種植，進(jìn)行形態(tài)DUS測(cè)試，從而達(dá)到對(duì)新品種鑒定的目的。目前黃瓜、柑橘、玉米、小麥等作物已經(jīng)構(gòu)建了SSR指紋圖譜運(yùn)用在品種鑒定方面。雖然目前白菜在構(gòu)建SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)這方面鮮有報(bào)道，王笑一[11]等已經(jīng)從131對(duì)SSR引物中篩選了2O對(duì)多態(tài)引物組合，對(duì)80個(gè)品種進(jìn)行了分析，利用其中5對(duì)引物Nal2E02、Nal2A08、Ni4D09、BRMS-269和BRMS-296的組合，可以將80個(gè)品種完全分開(kāi)，從而構(gòu)建了SSR指紋圖譜。

4 遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記在輔助育種上的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，從以往的利用雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行白菜品種的選育到現(xiàn)在的以分子標(biāo)記作為白菜品種的一種有效的輔助育種手段[12]。其中SSR標(biāo)記多態(tài)性高、共顯性遺傳、穩(wěn)定和可重復(fù)性好，適合于對(duì)蔬菜作物進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL定位和作為輔助育種的手段，單曉政[13]等運(yùn)用ISSR、RAPD、SSR、sRAP等分子標(biāo)記來(lái)構(gòu)建不結(jié)球白菜分子遺傳連鎖圖譜，分析結(jié)果表明構(gòu)建的連鎖圖譜包含l1個(gè)連鎖群，由139個(gè)標(biāo)記組成，包括19個(gè)RAPD標(biāo)記、22個(gè)SSR標(biāo)記、4個(gè)ISSR標(biāo)記和94個(gè)SRAP標(biāo)記。另外，原玉香[14]等利用SRAP、SSR、AFLP、STS、ESTP和CAPS等多種分子標(biāo)記和形態(tài)標(biāo)記，以大白菜晚抽薹DH系Y177-12和早抽薹DH系Y195-93為親本建立的183個(gè)DH系為作圖群體構(gòu)建了大白菜遺傳圖譜，為不同圖譜的比較與整合及重要農(nóng)藝性狀的基因定位奠定基礎(chǔ)。張明科[15]等利用231個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，以紫菜薹和結(jié)球白菜雜交的F2群體為材料，建立了包含163個(gè)標(biāo)記、11個(gè)連鎖群和4個(gè)片段的大白菜分子連鎖圖譜，其中包括117個(gè)RSAP標(biāo)記、38個(gè)SRAP標(biāo)記、5個(gè)SSR標(biāo)記和3個(gè)RAPD標(biāo)記。通過(guò)對(duì)圖譜的分析，該圖譜可有效的用于紫色等性狀的QTL定位分析。Yuefei Li[16]等，利用71個(gè)SSR標(biāo)記、145個(gè)SRAP標(biāo)記建立了黃芯白菜的分子鏈鎖圖譜，平均遺傳距離為3.8cm，分析結(jié)果顯示，有3個(gè)QTLs控制了白菜黃芯的性狀表現(xiàn)，40%發(fā)生了表型變異。

其中抗病育種是白菜育種者長(zhǎng)期關(guān)注的問(wèn)題之一，分子標(biāo)記技術(shù)在大白菜抗病育種中也進(jìn)行了一定量的研究。彭海濤[17]等利用群體分離分析法（BSA法）和SSR標(biāo)記進(jìn)行與不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒（TuMV）基因連鎖標(biāo)記的篩選。通過(guò)SSR引物篩選，得到54對(duì)在雙親間穩(wěn)定表現(xiàn)多態(tài)性的引物。其中1個(gè)與蕪菁花葉病毒抗病基因連鎖的SSR標(biāo)記Ra3E05，連鎖距離為8.7cm，根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)引物，用F：群體對(duì)其驗(yàn)證，帶型與原SSR標(biāo)記表現(xiàn)一致，可用于分子標(biāo)記輔助育種。

5 問(wèn)題與展望

綜上所述，目前在遺傳多樣性的分析、品種真實(shí)性和純度的鑒定以及在育種方面的研究中，SSR分子標(biāo)記與其他分子標(biāo)記類型相比，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在白菜的分子水平上的研究有著極大的應(yīng)用價(jià)值及潛力。但與棉花、水稻、玉米等作物在分子標(biāo)記方面的研究相比，都存在較大的差距，同時(shí)也具有較大的研究空間。在白菜需要審定和登記的新品種日益增多的情況下，對(duì)于其品種真實(shí)性及純度的鑒定上，SSR分子指紋技術(shù)具有重要的應(yīng)用前景?，F(xiàn)階段在這方面還鮮有報(bào)道，所以構(gòu)建白菜的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于品種鑒定是一種重要的分子技術(shù)手段，并與原有的形態(tài)DUS測(cè)試系統(tǒng)是相融合的。在白菜分子標(biāo)記輔助育種方面，對(duì)白菜進(jìn)行遺傳多樣性的分析和遺傳圖譜的構(gòu)建可以使育種者清楚的了解到種質(zhì)資源的遺傳背景，再根據(jù)其育種要求進(jìn)行改造和創(chuàng)新，培育出品質(zhì)優(yōu)良、抗逆性顯著及抗病蟲害較強(qiáng)的新品種，是我國(guó)育種者當(dāng)前比較重要的工作。

參考文獻(xiàn)

[1]李麗，鄭曉鷹.用于白菜和大白菜品種鑒定的EST-SSR復(fù)合標(biāo)記的建立.園藝學(xué)報(bào).2009，36（11）：1627-1634

[2]劉文，蕭鳳回，武劍，徐東輝，王曉武.大白菜和白菜群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2011，26（2）：156-163

[3]張明科，張魯剛，鞏振輝，惠麥俠.大白菜分子連鎖圖譜的構(gòu)建與分析.分子植物育種.2009，7（1）：82-88

[4]李麗，鄭曉鷹.AFLP分子標(biāo)記應(yīng)用于白菜品種鑒定.分子植物育種.2006，4（5）：685-689

[5]宋順華，鄭曉鷹.利用RAPD標(biāo)記鑒定大白菜雜交種純度的研究.華北農(nóng)學(xué)報(bào).2000，15（4）：35-39

[6]郭晶心，周乃元，馬榮才，曹鳴慶.白菜類蔬菜遺傳多樣性的AFLP分子標(biāo)記研究.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).2002，10（2）：138-143

[7]虞慧芳，鐘新民，陶躍之，唐侃，李必元.結(jié)球白菜種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的AFLP分析.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2008，20（5）：318-321

[8]楊華，劉灶長(zhǎng)，陳海榮，陳亮，羅利軍.上海地區(qū)蕓薹屬蔬菜遺傳多樣性研究.植物遺傳資源學(xué)報(bào).2006，7（3）：264-269

[9]杜黎明，胡天華，包崇來(lái)，朱琴妹，胡海嬌，毛偉海.白菜種質(zhì)遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR標(biāo)記分析.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào).2009，25（11）：20-24

[10]王笑一，于拴倉(cāng)，張鳳蘭，余陽(yáng)俊，趙岫云，張德雙.小白菜品種的SSR指紋圖譜及遺傳特異性分析.華北農(nóng)學(xué)報(bào).2008，23（5）：97-103

[11]張波.不結(jié)球白菜晚抽薹分子標(biāo)記及抽萎性的遺傳分析.2007，碩士論文，PP63

[12]Wanxing Wang， Shunmou Huang， Yumei Liu， Zhiyuan Fang， Limei Yang， Wei Hua， Suxia Yuan，Shengyi Liu， Jifeng Sun， Mu Zhuang， Yangyong Zhang and Aisong Zeng. Construction and analysis of a high-density genetic linkage map in cabbage （Brassica oleracea L. var. capitata）. BMC Genomics 2012， 13：523，PP12

[13]單曉政，李英，高素燕，馬成英，劉同坤，朱玉英，侯喜林.不結(jié)球白菜分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分析.西北植物學(xué)報(bào).2009，29（6）：1116-1121

[14]原玉香，張曉偉，孫日飛，王曉武，張慧，蔣武生，姚秋菊，耿建峰.大白菜遺傳圖譜的構(gòu)建及與染色體關(guān)聯(lián)分析.華北農(nóng)學(xué)報(bào).2010，25（3）：80-86

[15]張明科，張魯剛，鞏振輝，惠麥俠.大白菜分子連鎖圖譜的構(gòu)建與分析.分子植物育種.2009，7（1）：82-88

[16]Yuefei Li，Zhiyong Liu，Yushu Wang，Ning Yang，Xifeng Xin，Shuo Yang，Hui Feng. Identification of quantitative trait loci for yellow inner leaves in Chinese cabbage（Brassica rapa L. ssp. pekinensis） based on SSR and SRAP markers. Scientia Horticulturae .2012，133 ：10-17

[17]彭海濤，宋小明，侯喜林，李英.不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的遺傳分析及SSR標(biāo)記.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2012，28（2）：396-401

作者簡(jiǎn)介：張婉（1986.4-），女，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)。

李麗（1963.6-），女，碩士，職稱：高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向：利用分子標(biāo)記進(jìn)行雜交種純度及品種真實(shí)性鑒定。

通訊作者：李麗

*通訊作者：lili@nercv.org