高 靜，郭旭生，王國成

(1．蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州730020； 2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730000；3.蘭州大學(xué)青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心，甘肅 蘭州 730000)

高寒草地畜牧業(yè)是西藏農(nóng)牧民賴以生存的基礎(chǔ)，是西藏經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要支柱，更是國家生態(tài)安全的基本保證[1]。西藏地區(qū)被稱為“世界第三極”，氣候極端，生態(tài)環(huán)境脆弱，畜牧業(yè)發(fā)展面臨牧草生長緩慢、畜群結(jié)構(gòu)不合理及天然草地退化等問題，限制了西藏草地畜牧業(yè)的快速發(fā)展。青貯飼料不僅適口性好、消化率高，還能長期保存，且受氣候和外界環(huán)境影響較小，可以有效改善西藏飼料短缺的困境[2-3]。因此，青貯飼料是解決西藏地區(qū)草畜季節(jié)性供應(yīng)不平衡的理想措施之一。

目前，我國主要是通過購買國外商品乳酸菌進(jìn)行青貯飼料的調(diào)制，這些商品菌適宜的生長溫度一般是25 ℃，但西藏地區(qū)牧草收獲期氣溫較低，一般只有15 ℃。同時(shí)，有關(guān)乳酸菌篩選的研究主要為常規(guī)條件下的乳酸菌研究，而就極端環(huán)境中乳酸菌有關(guān)理化特性和應(yīng)用基礎(chǔ)等方面的研究鮮有報(bào)道。我國大多乳酸菌在青貯飼料中的研究主要為利用商品化乳酸菌制劑進(jìn)行試驗(yàn)[4-7]，而有關(guān)牧草中天然附著乳酸菌的篩選研究與應(yīng)用方面還十分薄弱，最近幾年才有所報(bào)道[8-11]。關(guān)于我國高寒地區(qū)乳酸菌的研究有高原酸奶、青貯飼料和類開菲爾粒中提取的相關(guān)報(bào)道[12]，但有關(guān)高寒地區(qū)牧草附著乳酸菌的研究還未見報(bào)道。在我國高寒高海拔地區(qū)，通過牧草青貯發(fā)酵可以獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料，這些青貯飼料色綠、酸香味濃、適口性好，幾乎沒有二次發(fā)酵的現(xiàn)象[13-14]，說明在我國高寒地區(qū)或許存在可以在低溫環(huán)境中發(fā)酵飼料的特殊乳酸菌。針對(duì)以上情況，開展我國高寒地區(qū)牧草附著乳酸菌特性的研究十分必要，而對(duì)其與其它生境提取的乳酸菌理化性質(zhì)的比較研究也很重要。因此，本研究以西藏高寒地區(qū)分布范圍廣、面積大、牧草飼用價(jià)值較高的藏北嵩草(Kobresialittledalei)為原料[15-16]，對(duì)其附著乳酸菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)比研究其與對(duì)照菌株的生理生化等特性，明確青藏高原乳酸菌特性，為其在飼料青貯、酸奶發(fā)酵等應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株 試驗(yàn)所用乳酸菌菌株是從2010年7月初采自西藏高寒草甸的藏北嵩草中分離純化，并采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和16S rRNA序列分析鑒定后得到的，詳見楊楊等[17]的方法。將于-80 ℃保存的菌株活化后，接種到MRS斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2培養(yǎng)基 試驗(yàn)用培養(yǎng)基參考凌代文[18]的方法配制。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g，牛肉膏10.00 g，蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g， K2HPO45.00 g，檸檬酸銨2.00 g，MnSO40.25 g，CaCO32.00 g，乙酸鈉5.00 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，瓊脂粉20.00 g，1 mL吐溫-80，加蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至6.20，121 ℃下滅菌15 min。

PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：100 mL蒸餾水中加入1.00 g酵母提取物，0.50 g胰酶解酪朊，0.50 g蛋白胨，4.00 mL鹽溶液。其中鹽溶液為1 000 mL蒸餾水中溶入10.00 g碳酸氫鈉，1.00 g磷酸二氫鉀，0.48 g MgSO4·7H2O，0.20 g氯化鈣，1.00 g磷酸氫二鉀，2.00 g氯化鈉。

1.3試驗(yàn)儀器和設(shè)備 超凈工作臺(tái)(YJ-875，蘇州凈化設(shè)備公司)，高壓滅菌鍋 (MLS-3780，三洋公司)，pH儀(E-201-C，上海雷磁儀器廠)，恒溫培養(yǎng)箱。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，研究3種分離的乳酸菌腸膜明串珠菌腸膜亞種、融合魏斯氏菌和食物魏斯氏菌在不同溫度、不同pH條件下的生長特性及糖發(fā)酵、耐鹽等特性，并以相對(duì)應(yīng)的3種標(biāo)準(zhǔn)菌作為對(duì)照。

1.5試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目

1.5.1不同溫度條件下各菌株的生長特性 將備好的MRS培養(yǎng)液以5 mL量分裝試管，于121 ℃高壓滅菌15 min。將試驗(yàn)菌株以相同的接種量(0.1 mL)接入培養(yǎng)液中，搖勻，塞子封口，各設(shè)兩個(gè)重復(fù)，分別放在溫度為4、10、15、25、30、40和50 ℃的水浴鍋中培養(yǎng)，其中4、10 ℃培養(yǎng)14 d，40、50 ℃培養(yǎng)7 d，其余培養(yǎng)2 d，觀察菌株的生長情況。

1.5.2不同pH條件下各菌株的生長特性 所用培養(yǎng)基是將MRS培養(yǎng)液用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH值至所需酸堿度，即pH值分別為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0和9.5。同上步驟，將試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基以100 μL的接種量分別接入滅過菌的培養(yǎng)基中，各設(shè)兩個(gè)重復(fù)，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，觀察菌株的耐酸堿能力。

1.5.3各菌類的耐鹽特性 所用培養(yǎng)基是在MRS培養(yǎng)液中加入所需NaCl，將備好的MRS培養(yǎng)液(3% NaCl、6.5% NaCl和18% NaCl)以5 mL量分裝入試管。經(jīng)121 ℃高壓滅菌15 min，將試驗(yàn)菌株以相同的接種量(0.1 mL)接入所需培養(yǎng)基中，各設(shè)兩個(gè)重復(fù)，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d并觀察菌株的耐鹽能力。其中NaCl的百分含量是指100 mL培養(yǎng)液中含有NaCl的克數(shù)。

1.5.4糖源利用試驗(yàn) 按Cai等[19]相關(guān)文獻(xiàn)介紹，本次糖源利用試驗(yàn)共挑取了乳糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、D-核糖、苦杏仁苷、甘露糖、麥芽糖、鼠李糖、棉子糖、水楊苷、果糖、半乳糖、密二糖、纖維二糖、葡萄糖酸鹽、七葉苷、山梨醇和甘露醇，共19種糖源。試驗(yàn)采取了糖發(fā)酵生化反應(yīng)管法(發(fā)酵試劑由杭州天和微生物試劑有限公司提供)。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置無糖處理(培養(yǎng)基中末加所需測(cè)定的糖。但接種試驗(yàn)菌株)和空白處理(培養(yǎng)基中加入所需測(cè)定的糖，但末接種試驗(yàn)菌株)，各設(shè)兩個(gè)重復(fù)。操作方法參照生化反應(yīng)管的說明書進(jìn)行(將已經(jīng)培養(yǎng)好的不同試驗(yàn)菌用接種針分別接入含有不同糖的反應(yīng)管中，放置30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察發(fā)酵情況)。

1.5.5精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn) 采用的培養(yǎng)基是在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入精氨酸液。將試驗(yàn)菌株分別接種于含精氨酸和不含精氨酸的培養(yǎng)基，以作對(duì)照。30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，再將培養(yǎng)好的培養(yǎng)液倒入比色皿中，添加奈氏試劑，如果有氨產(chǎn)生則會(huì)有橙黃色或黃褐色沉淀出現(xiàn)。反應(yīng)現(xiàn)象明顯強(qiáng)于對(duì)照組認(rèn)為是陽性反應(yīng)。

配置精氨酸液：在10 mL蒸餾水中加入1.50 g·L-1精氨酸和0.05 mL半胱氨酸， pH值調(diào)至7.0，滅菌，吸取3滴到3 mL PY基礎(chǔ)培養(yǎng)液中。

奈氏試劑：A液為50 mL的蒸餾水中加入20.00 g KOH；B液為5.00 g KI和10.00 g HgI2溶入至50 mL蒸餾水所得溶液。A液和B液混合均勻，過濾，存于棕色瓶備用。

2 結(jié)果

2.1藏北嵩草分離乳酸菌的鑒定結(jié)果 本試驗(yàn)分離得到19個(gè)菌株，經(jīng)過傳統(tǒng)培養(yǎng)法和16S rRNA序列分析，分離鑒定出3種菌，分別是腸膜明串珠菌腸膜亞種2株，融合魏斯氏菌11株，食物魏斯氏菌6株(表1)。

2.23種試驗(yàn)菌的生理特征比較 從藏北嵩草分離的3種試驗(yàn)菌(融合魏斯氏菌、食物魏斯氏菌和腸膜明串珠菌腸膜亞種)都能在4 ℃下生長，而且在10 ℃時(shí)生長活力旺盛，但相同的3種對(duì)照菌在10 ℃才能微弱生長甚至不生長(表1)。試驗(yàn)菌株在6.5%的NaCl培養(yǎng)基中生長良好，部分菌株還能在18%的NaCl培養(yǎng)基中生長，而對(duì)照菌株未生長。在不同pH值下，大多菌株可以在pH值為4.0～9.0的范圍內(nèi)生長，部分試驗(yàn)菌株能在pH為3.0或9.5的條件下生長，而對(duì)照菌株在pH為3.0或9.5時(shí)未生長。

2.33種試驗(yàn)菌的生化特征比較 3種試驗(yàn)菌都可以利用葡萄糖產(chǎn)生酸；魏斯氏屬中除了1個(gè)菌株外，其它菌株都能利用阿拉伯糖；在半乳糖的利用情況上，魏斯氏屬有15個(gè)菌株可利用半乳糖，而有2個(gè)菌株為不確定反應(yīng)(表2)。對(duì)照菌組融合魏斯氏菌不能利用棉籽糖、阿拉伯糖和蜜二糖，但能發(fā)酵半乳糖、纖維二糖、麥芽糖、D-核糖等；食物魏斯氏菌株能利用阿拉伯糖，但不能利用半乳糖等；但本試驗(yàn)中提取魏斯氏屬菌株的糖源利用試驗(yàn)表明，提取菌株均能利用阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、纖維二糖、麥芽糖、果糖和蔗糖等。同樣，試驗(yàn)菌株腸膜明串珠屬除了不能利用葡萄糖酸鹽和鼠李糖外，均可利用葡萄糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、纖維二糖、棉籽糖、果糖、蔗糖、半乳糖、七葉苷、密二糖、水楊苷和苦杏仁苷。根據(jù)腸膜明串珠屬乳酸菌的糖源利用鑒定方法，常規(guī)條件下的腸膜明串珠腸膜亞種對(duì)麥芽糖、半乳糖、D-核糖、甘露糖、水楊苷、密二糖的發(fā)酵能力較差，一般也不能利用精氨酸產(chǎn)氨，但是本試驗(yàn)所提取的試驗(yàn)菌可以利用上述幾種糖類，并且可以利用精氨酸產(chǎn)氨。

表1 3種試驗(yàn)菌及其對(duì)照菌的生理特征Table 1 Physiological characteristics of three kinds of test bacteria’s and their controls

表2 3種試驗(yàn)菌及其對(duì)照的生化特征Table 2 Biochemical characteristics of three kinds of test bacteria’s and their controls

3 討論

李文斌等[22]和張剛[23]報(bào)道，當(dāng)溫度為30～40 ℃時(shí)常規(guī)明串珠和魏斯氏菌生長旺盛，且其最適pH為5.5～6.2，當(dāng)pH≤5時(shí)可以生長，pH<4.4 則停止生長，而在初始?jí)A性或中性環(huán)境中生長速率降低。在4 ℃的條件下，從藏嵩草中分離的乳酸菌能夠生長，而溫度達(dá)到10 ℃時(shí)生長旺盛，但本試驗(yàn)的菌株對(duì)溫度的要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于從日本東京的青貯飼料中分離出的3種菌株(食物魏斯氏菌、融合魏斯氏菌和腸膜明串珠菌腸膜亞種)，它們?cè)?0 ℃條件下只能微弱生長[19-20]。青藏高原高寒環(huán)境的特殊性可能是造成本研究中乳酸菌對(duì)低溫適應(yīng)特性的主要原因。另外，本研究表明，部分菌株還能在pH為3的條件下生長，體現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸能力。由此可見，從青藏高原極端環(huán)境中分離的乳酸菌具有相對(duì)較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。

從目前的研究資料來看，食物魏斯氏菌和融合魏斯氏菌多分離自人類或其他動(dòng)物[24-25]。研究表明，僅從形態(tài)和菌落特征方面是很難區(qū)分這兩種菌的，但可以從發(fā)酵的糖類區(qū)分二者，食物魏斯氏菌能發(fā)酵阿拉伯糖，但是不能發(fā)酵木糖和半乳糖，而融合魏斯氏菌不能發(fā)酵棉籽糖、阿拉伯糖和蜜二糖，但是能發(fā)酵核糖、半乳糖、麥芽糖和纖維二糖等[18,26]。雖然有研究表明，玉米(Zeamays)青貯飼料附著的融合魏斯氏菌乳酸菌可利用阿拉伯糖，但是其利用能力比較弱，分離的食物魏斯氏乳酸菌不能完全利用半乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸[27]。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于高寒環(huán)境中魏斯氏乳酸菌對(duì)碳源的利用可能比其它環(huán)境中分離出的菌種更具廣泛性，因此從藏嵩草中分離的融合魏斯氏菌絕大部分菌株均能發(fā)酵阿拉伯糖，且分離鑒定的食物魏斯氏乳酸菌都可以利用半乳糖。明串珠菌屬廣泛分布于植物、泡菜、發(fā)酵乳制品和青貯料中。本研究分離的菌株都可以完全利用甘露糖、水楊苷、D-核糖、蜜二糖和半乳糖，而對(duì)照菌腸膜明串珠菌腸膜亞種對(duì)這些糖的利用效率不高[18,24]。從碳源利用的角度看，本研究中的腸膜明串珠菌腸膜亞種對(duì)碳源的利用比在其它環(huán)境中分離得到的菌株更強(qiáng)。

4 結(jié)論

通過對(duì)各菌種生理生化特性的比較研究發(fā)現(xiàn)，本研究分離得到的魏斯氏乳酸菌和明串珠菌對(duì)生長環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性，溫度在4～40 ℃條件時(shí)，大多菌株都能生長，有些菌株甚至能在50 ℃的條件下生長。在耐酸堿試驗(yàn)中，本研究中的菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸堿性，當(dāng)pH為3.0和9.5時(shí)有些菌株依舊能夠生長。本研究中分離出的食物魏斯氏乳酸菌可以發(fā)酵半乳糖，融合魏斯氏菌可以發(fā)酵甘露醇、密二糖和阿拉伯糖，這表明在利用糖源方面，高寒乳酸菌比常規(guī)乳酸菌更廣泛。因此，青藏高原極端環(huán)境中分離的乳酸菌不僅利用的糖源更廣泛，而且環(huán)境適應(yīng)性和對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性相對(duì)較強(qiáng)，這些特殊性有助于進(jìn)一步進(jìn)行青藏高原乳酸菌的開發(fā)應(yīng)用研究。

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