劉博欣，趙楊敏，龐俊峰，孫占敏，尉亞輝，吳燕民

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081； 2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069；3.深圳市農(nóng)科集團(tuán)有限公司，廣東 深圳 518040； 4.南京理工大學(xué)無錫研究院，江蘇 無錫 214192)

紅樹林是熱帶、亞熱帶海岸河口地區(qū)潮間帶木本植物群落，是世界上生產(chǎn)力較高的自然群落之一[1]，其重要的生理環(huán)境特征是高鹽分[2]。鹽度的大小對紅樹植物的生長、水分代謝、光合作用、呼吸作用、離子吸收、酶系活動(dòng)以及超微結(jié)構(gòu)等都有明顯影響[3]，生長在該環(huán)境下的植株在長期進(jìn)化過程中，也必然形成了一套獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制。秋茄(Kandeliaobovata)是我國境內(nèi)天然分布最廣且分布緯度最高的紅樹植物，為紅樹科(Rhizophoraceae)秋茄屬植物，有“胎生”的生育特性[4]。

轉(zhuǎn)錄因子在植物的脅迫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用[5-6]。乙烯應(yīng)答因子(Ethylene-Responsive Factors，ERFs)類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[7-9]，主要由DNA結(jié)合域、核定位信號域(NLS)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控域3個(gè)功能區(qū)組成，在植物的非生物脅迫應(yīng)答中具有重要的功能，特別是表現(xiàn)出對鹽堿的耐受作用[10]。因此，克隆KcERF基因?qū)橹参锘蚬こ填I(lǐng)域增添新的抗逆基因源，在轉(zhuǎn)基因生物新品種的培育方面具有重要意義。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1植物材料 從深圳紅樹林中采集秋茄枝條，將秋茄嫩枝在200 mmol·L-1的NaCl中浸泡處理5 h，摘取幼嫩葉片后立即進(jìn)行液氮處理，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2秋茄總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol試劑法提取秋茄總RNA。經(jīng)Dnase I處理去除基因組DNA后用Promega公司的試劑反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體操作步驟如下:1)在RNase-free的0.5 mL離心管中加入3 μL RNA，1 μL Oligo dT，用ddH2O補(bǔ)足至12 μL，將混合液置于70 ℃水浴5 min，迅速放于冰上冷卻2 min。2)再加入4 μL 5×Reaction buffer，2 μL dNTP，1 μL RNase inhibitor，42 ℃水浴2 min后加入1 μL M-MLV reverse transcriptase，將離心管置于42 ℃水浴反應(yīng)50 min，再將反應(yīng)管置于70 ℃水浴15 min后終止反應(yīng)。產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3KcERF基因的克隆 利用DNAMAN對已報(bào)道的AP2亞家族的基因序列進(jìn)行比較，分析其保守序列并設(shè)計(jì)簡并引物，PCR擴(kuò)增秋茄ERF片段。

參考Scotto-Lavino等[11]的方法進(jìn)行3′RACE。以秋茄cDNA作為模板，分別用基因特異引物QEF3-1和QEF3-2與3′RACE反向引物3′-outer和3′-Inner，進(jìn)行50 μL體系的兩輪PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化后連接pMD19-T克隆載體。載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取陽性單克隆測序。測序由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物基因資源與遺傳改良國家重大工程開放實(shí)驗(yàn)室測序部完成。

參考Scotto-Lavino等[12]的方法進(jìn)行5′RACE。分別用基因特異引物QER5-1和QER5-2與5′RACE正向引物5′-outer和5′-inner，進(jìn)行50 μL體系的兩輪PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化后連接pMD19-T克隆載體。載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取陽性單克隆測序。

將3′RACE和5′RACE擴(kuò)增結(jié)果用DNAMAN拼接初步得出全序列，依照拼接結(jié)果設(shè)計(jì)全序列上、下游引物。以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到基因，得到1 200 bp左右產(chǎn)物條帶。測序結(jié)果為1 209 bp，將其命名為KcERF。

利用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列比對和分析；利用在線ORF finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cg)分析KcERF基因的開放閱讀框；利用在線SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析CDS區(qū)典型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域；利用在線ExPASy Compute pI/Mw tool軟件(http://www.expasy.ch/tools/pitool.html)和FeatureMap3D軟件對KcERF蛋白進(jìn)行物理性質(zhì)、三維空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測；利用NCBI-BLAST 及DNAMAN軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.4KcERF的亞細(xì)胞定位 用引物GFPHK-F和GFPHK-R從連接有KcERF cDNA全長的pMD19-T載體上擴(kuò)增出完整開放閱讀框。擴(kuò)增產(chǎn)物與帶有GFP綠色熒光蛋白報(bào)告基因的P163-GFP載體分別經(jīng) HindIII+ BamHI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳并回收，用T4-DNA連接酶將KcERF連接在p163-GFP載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建與GFP融合的表達(dá)載體p163-GFP-KcERF。經(jīng)過鑒定后，用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥(Aliumcepa)表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24 h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察KcERF的亞細(xì)胞定位。

1.5KcERF基因轉(zhuǎn)錄激活功能驗(yàn)證 用引物對KEZ-F和KEZ-R從pMD19T-KcERF載體上擴(kuò)增出KcERF完整開放閱讀框。擴(kuò)增產(chǎn)物和pbridge各自經(jīng)EcoRI+SalI雙酶切、1%瓊脂糖凝膠電泳并回收，用T4連接酶將目標(biāo)基因連接至pbridge載體，構(gòu)建酵母融合效應(yīng)質(zhì)粒pbridge-KcERF。轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性濾紙分析及β-半乳糖苷酶活性測定。

1.6過表達(dá)KcERF轉(zhuǎn)錄因子耐鹽功能分析 利用引物KcERF-XbaI-F和KcERF-KpnI-R從連接有全長KcERF cDNA的pMD19-T載體上擴(kuò)增出完整的開放閱讀框。擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pUCST4A進(jìn)行XbaI、KpnI雙酶切，用T4連接酶將KcERF與載體pUCST4A進(jìn)行連接，構(gòu)建中間表達(dá)載體pUCST4A-KcERF，中間載體與載體pCAMBIA2301經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳并回收，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建植物表達(dá)載體pC2301-P35S-KcERF。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)。并進(jìn)行kan抗性篩選、GUS報(bào)告基因檢測、基因組PCR與RT-PCR檢測，選取結(jié)果均為陽性的煙草植株進(jìn)行不同時(shí)間的NaCl梯度濃度脅迫[10]，測量煙草植株耐鹽形態(tài)學(xué)差異并進(jìn)行生理生化指標(biāo)測定。

用移栽生長2周的煙草植株進(jìn)行 NaCl梯度濃度脅迫，其濃度分別為0、120、240、360 mmmol·L-1，且每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，共24株煙草(其中，轉(zhuǎn)KcERF基因煙草12株，野生型煙草12株)。

脅迫處理方式：每隔 3 d，補(bǔ)澆一次NaCl溶液，自然條件下生長90 d，并分別在0、7、14、21 d取樣，用液氮處理后，置于-80 ℃保存。

形態(tài)學(xué)測量方式：在 0、7、14、21 d分別對煙草心葉長半軸、短半軸長及株高進(jìn)行測量，煙草心葉面積以近似橢圓面積(S)計(jì)算:S=0.634 5ab[13]，a、b分別是煙葉的長半軸、短半軸的長，0.634 5為煙草葉面積指數(shù)。

脅迫處理后植株葉片組織含水量的測定：對不同濃度NaCl脅迫處理的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草，分別在 0、7、14、21 d 取葉片，每個(gè)處理取3個(gè)樣本，并迅速測其鮮質(zhì)量。

丙二醛(MDA)及可溶性糖的測定：取葉片0.5 g，液氮冷凍并用組織破碎儀破碎后，加入1 mL 0.5%TBA，渦旋震蕩勻漿后，再將上述勻漿轉(zhuǎn)移入潔凈10 mL EP管并編號(對照加1 mL蒸餾水)，然后再加入0.5%TBA溶液5 mL，混勻后在水浴中沸煮反應(yīng) 15 min至反應(yīng)充分后；迅速放入冰中冷卻10 min，吸取上清低速離心；然后用分光光度計(jì)分別測450、532和600 nm波長處上清液的吸光度值[14]。

轉(zhuǎn)基因植株葉片組織相對電導(dǎo)率分析：稱取經(jīng)脅迫處理的煙草葉片0.2 g于10 mL EP管中，加入5 mL去離子水，自然浸泡1 h，之后測定電導(dǎo)率J1并記錄，然后放入沸水浴中煮沸10 min，冷卻至室溫測電導(dǎo)率并記錄[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1基因全長的克隆及生物信息學(xué)分析 本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)科屬植物的AP2/ERF亞家族基因的cDNA序列設(shè)計(jì)簡并引物，以RNA為模板經(jīng)RT-PCR反應(yīng)獲得大小為270 bp的目的片段。在已知序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行3′RACE和5′RACE，然后將3′RACE和5′RACE擴(kuò)增結(jié)果用軟件拼接得出全序列。根據(jù)序列設(shè)計(jì)上、下游引物，擴(kuò)增得到cDNA序列，命名為KcERF。同時(shí)用該引物擴(kuò)增基因組DNA得到DNA序列。

將KcERF轉(zhuǎn)錄因子的ORF進(jìn)行分析，KcERF基因全cDNA序列中存在873 bp的開放閱讀框，編碼290個(gè)氨基酸。SMART軟件對KcERF基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，顯示KcERF轉(zhuǎn)錄因子在54-117位含有一個(gè)典型的AP2結(jié)構(gòu)域。Inter ProScan分析表明，290個(gè)氨基酸序列編碼的是AP2/EREBP家族中的ERF類轉(zhuǎn)錄因子。ExPASy Compute pI/Mw tool預(yù)測蛋白等電點(diǎn)為7.15，分子量為31.45 kDa。利用在線Protscale預(yù)測分析結(jié)果，KcERF所編碼的蛋白質(zhì)中疏水性最大值是1.667，最小值是-3.011，表明KcERF蛋白主要由親水性區(qū)域組成；且存在76.55%的殘基暴露在蛋白表面，23.45%的其余殘基置于蛋白內(nèi)部，也說明親水性比疏水性強(qiáng)。在NCBI中搜索AP2/ERF家族已克隆基因mRNA序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行基因序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明秋茄ERF基因與擬南芥(Arabidopsisthaliana)等作物聚類在一起，系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系在81%左右(圖1)。利用FeatureMap3D軟件對秋茄ERF蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，基因KcERF所編碼的蛋白空間結(jié)構(gòu)中分別具有1個(gè)α螺旋和3個(gè)β折疊，這是典型的ERF類轉(zhuǎn)錄因子所具有的空間結(jié)構(gòu)。

圖1 KcERF轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of KcERF

2.2KcERF的亞細(xì)胞定位 在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察KcERF基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果(圖2)顯示，在轉(zhuǎn)化p163-GFP-KcERF重組質(zhì)粒的洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光僅出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)；而在轉(zhuǎn)化空載體p163-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞對照中，綠色熒光彌散整個(gè)細(xì)胞；故KcERF轉(zhuǎn)錄因子為核定位蛋白。

2.3KcERF基因轉(zhuǎn)錄激活功能驗(yàn)證 為了分析KcERF是否具有轉(zhuǎn)錄激活的能力，把KcERF基因完整的開放閱讀框連接于pbridge載體上，構(gòu)建酵母效應(yīng)質(zhì)粒pbridge-KcERF，轉(zhuǎn)化DH-5α，篩選陽性克隆。氯化鋰法轉(zhuǎn)化效應(yīng)質(zhì)粒pbridge-KcERF于酵母菌株AH109。在SD-His-Trp平板上，僅含有效應(yīng)質(zhì)粒pbridge-KcERF的酵母菌株才能正常生長(圖3)，說明效應(yīng)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入。用滅菌的whatman濾紙，進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的濾紙檢測，其結(jié)果效應(yīng)質(zhì)粒pbridge-KcERF均呈現(xiàn)出藍(lán)色，pbridge無顏色反應(yīng)(圖4)。β-半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果為185.03 U(表1)，與陽性對照GAL4的36.26 U相比，表明KcERF的轉(zhuǎn)錄激活活性較強(qiáng)。

圖2 KcERF-GFP 與 GFP 蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.2 The subcellular localization of KcERF-GFP and GFP

圖3 含有重組質(zhì)粒的酵母菌株在SD-Trp和SD-His-Trp平板上的生長情況Fig.3 The growth of yeast containing recombinant plasmids on SD-Trp and SD-His-Trp

圖4 KcERF蛋白在酵母系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活功能分析Fig.4 Transcriptional activation assay of KcERF protein in yeast system

表 1 KcERF的β-半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果 Table 1 The β-galactosidase activity detection results of KcERF

2.4轉(zhuǎn)KcERF基因煙草的形態(tài)學(xué)分析 比較鹽脅迫下轉(zhuǎn)KcERF基因和野生型煙草株高的變化可以看出，在脅迫21 d時(shí)對野生型煙草株高的脅迫效應(yīng)顯著，而對轉(zhuǎn)基因煙草的影響不明顯(圖5)。

另外，從鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因型和野生型煙草葉片的影響可以看出，NaCl對野生型煙草的葉片的影響從脅迫7 d開始有明顯變化，而對轉(zhuǎn)KcERF基因煙草的影響不明顯(圖6)。

圖5 鹽脅迫對煙草株高的影響 Fig.5 Effects of salt stress on plant height of transgenic and wild tobacco plants

圖6 鹽脅迫對煙草心葉面積的影響 Fig.6 Effects of salt stress on leaf area of transgenic and wild tobacco plants

2.5轉(zhuǎn)KcERF基因煙草的耐鹽功能分析 植物組織含水量是植物組織內(nèi)水分情況的一個(gè)生理指標(biāo)。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，高鹽使植物遭受滲透脅迫，細(xì)胞失水，嚴(yán)重可致死[16]。根據(jù)不同濃度鹽脅迫下煙草葉片含水量變化趨勢可以看出(圖7)，在高濃度的NaCl處理下，轉(zhuǎn)KcERF基因的煙草含水量變化不明顯，而野生型呈下降趨勢，較KcERF型煙草下降約20%，結(jié)果顯著。證明KcERF基因可減緩高鹽對植物產(chǎn)生的離子毒害、滲透脅迫及生理干旱。

逆境脅迫植物時(shí)，植物發(fā)生膜脂過氧化，MDA含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度，是膜脂過氧化的一種終產(chǎn)物。本研究比較了轉(zhuǎn)KcERF基因煙草與野生型煙草在不同濃度鹽脅迫下煙草MDA含量的差異(圖8)。在高濃度的NaCl處理下，轉(zhuǎn)KcERF基因煙草的MDA含量變化趨勢小，而野生型表現(xiàn)高增長率，在240 mmol·L-1NaCl脅迫0～14 d，處于動(dòng)態(tài)平衡，MDA含量維持在0.007 μmol·g-1左右，脅迫21 d之后MDA含量顯著升高至0.022 μmol·g-1，是脅迫前(0.007 μmol·g-1)的3倍多；在360 mmol·L-1NaCl脅迫下，MDA含量打破了動(dòng)態(tài)平衡，呈現(xiàn)趨于直線增長的趨勢，表明植株受到高鹽脅迫，膜脂過氧化作用嚴(yán)重，植物體已從抵御狀態(tài)進(jìn)入防御階段(圖8)。這表明，插入外源轉(zhuǎn)錄因子KcERF，緩解了高鹽脅迫對煙草的毒害作用，降低了膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的含量，從而保證細(xì)胞內(nèi)脂膜的完整性，提高了轉(zhuǎn)基因煙草在高鹽逆境下的抗鹽及耐鹽性。

圖7 鹽脅迫下煙草的含水量的變化Fig.7 Variation of water content in tobacco under salt stress

圖8 鹽脅迫下煙草MDA含量的變化 Fig.8 Variation of MDA content in tobacco under salt stress

可溶性糖是植物在低溫、高鹽或干旱條件下產(chǎn)生的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),可以維持滲透平衡、保護(hù)蛋白質(zhì)分子、增加蛋白質(zhì)分子的水合度并維持光合特性,還可作為活性氧的清除劑消除脅迫所造成的傷害[17-19]。在不同濃度鹽脅迫下，對于野生型煙草而言，具有一致的可溶性糖含量變化趨勢，即先下降后上升(圖 9)?？赡苁怯捎谠邴}脅迫初期，其光合作用受到抑制，葡萄糖合成減少，導(dǎo)致可溶性糖含量降低，隨著脅迫時(shí)間的積累，植物體內(nèi)對鹽脅迫產(chǎn)生了應(yīng)答機(jī)制，植物自身會(huì)產(chǎn)生并積累一些小分子有機(jī)物來抵抗逆境，可溶性糖就是這些有機(jī)物質(zhì)之一。而轉(zhuǎn)KcERF基因煙草可溶性糖含量呈上升趨勢。在240 mmol·L-1NaCl脅迫14 d時(shí)表現(xiàn)極顯著差異(P=0.006)；在360 mmol·L-1NaCl 脅迫14 d時(shí)表現(xiàn)顯著差異(P=0.021)，表明轉(zhuǎn)KcERF基因煙草在鹽脅迫下可溶性糖含量高于野生型，有利于緩解植物因高鹽逆境所帶來的毒害作用，通過細(xì)胞內(nèi)積累的小分子碳水化合物如可溶性糖，利用滲透調(diào)節(jié)來維持較高的滲透壓，從而維持細(xì)胞的正常生理代謝。

正常情況下，細(xì)胞膜對物質(zhì)具有選擇通透性；但逆境條件下，如干旱、低溫、高鹽及病害等，使質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能受到不同程度的傷害，從而引起質(zhì)膜通透性變大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，以致植物細(xì)胞組織浸提液的電導(dǎo)率增大。因此，相對電導(dǎo)率可以反映植物細(xì)胞膜在各種逆境條件下透性變化和細(xì)胞膜受損傷的程度。一般認(rèn)為耐鹽能力強(qiáng)的植物在鹽脅迫下，細(xì)胞膜透性變化較小，敏感植物則變化大[20]。本研究表明，野生型煙草在NaCl的脅迫下電導(dǎo)率處于持續(xù)增長狀態(tài)；而轉(zhuǎn)基因型煙草表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(圖10)。說明在鹽脅迫條件下，野生型植物的細(xì)胞膜因高濃度鹽的影響，受到不同程度的損傷，而插入KcERF轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植株，可以在逆境脅迫初期產(chǎn)生應(yīng)答機(jī)制，緩解高鹽對細(xì)胞膜的損傷，從而保證植株在高鹽逆境中能維持正常生長發(fā)育。

圖9 鹽脅迫下煙草可溶性糖含量的變化 Fig.9 Variation of soluble sugar content in tobacco under salt stress

圖10 鹽脅迫下煙草相對電導(dǎo)率的變化 Fig.10 Variation of relative conductivity in tobacco under salt stress

3 討論

秋茄對鹽堿具有很強(qiáng)的忍耐性。近年來，諸多學(xué)者對秋茄的耐鹽機(jī)制進(jìn)行了一系列的研究，如根、葉中導(dǎo)致鹽離子不易通過的三萜醇含量隨著鹽濃度的升高而增加，而磷脂和脂肪酸的組成沒有變化[21]。在一定鹽濃度范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增加，秋茄細(xì)胞中的質(zhì)膜ATP酶活性、電化學(xué)勢梯度和跨膜質(zhì)子梯度增加[22]。秋茄中含量較高的多酚具有很強(qiáng)的自由基清除能力，還可以抑制氧化酶，絡(luò)合對氧化反應(yīng)起催化作用的金屬離子Fe3+和Cu2+[23]。在秋茄的總滲透調(diào)節(jié)中，無機(jī)滲透調(diào)節(jié)占87.8%，最重要的是Na+和Cl-；有機(jī)滲透調(diào)節(jié)占12.2%，其中可溶性糖占主要地位[24]。

本研究從秋茄中克隆了ERF轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)基因KcERF，屬于AP2/EREBP家族中的ERF類轉(zhuǎn)錄因子[25]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其與擬南芥親緣關(guān)系最高，在81%左右。KcERF融合表達(dá)的GFP在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況顯示：KcERF定位于細(xì)胞核，據(jù)此認(rèn)為KcERF是在細(xì)胞核中調(diào)控基因表達(dá)的。根據(jù)研究表明，乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ERF蛋白直接與ERF 上游的PERE(Previously Identified Ethylene-Response Element)組件結(jié)合，從而啟動(dòng)下游基因的表達(dá)[5]。因此看出，KcERF類轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生作用，與亞細(xì)胞定位結(jié)果相符。酵母單雜交試驗(yàn)表明，KcERF基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性，且β-半乳糖苷酶活性為185.03 U，與陽性對照GAL4的36.26相比，KcERF具有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性。

秋茄作為紅樹林的代表植物，對鹽堿有良好的抗性作用[26]。為了研究KcERF轉(zhuǎn)錄因子對植物發(fā)揮的作用，構(gòu)建了含有KcERF轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因煙草，并與野生型煙草進(jìn)行了不同濃度、不同時(shí)間的NaCl處理。對轉(zhuǎn)KcERF基因的煙草植株的株高與葉片面積進(jìn)行測量得出，從生物形態(tài)學(xué)上，轉(zhuǎn)KcERF基因的植株對NaCl表現(xiàn)出顯著的抗性。從生理指標(biāo)上進(jìn)一步分析其原因發(fā)現(xiàn)，含水量、MDA含量、可溶性糖含量、相對電導(dǎo)率均反映出轉(zhuǎn)KcERF基因的煙草受到高鹽逆境脅迫時(shí)，基本保持正常生長狀態(tài)，而野生型煙草受到不同程度的損傷。值得一提的是，在可溶性糖含量的測定中，野生型煙草表現(xiàn)出先下降后上升趨勢，理論推測可能是由于鹽脅迫初期，光合作用受到抑制，葡萄糖合成減少，導(dǎo)致可溶性糖含量降低，而隨著鹽脅迫的積累，植物體內(nèi)對脅迫產(chǎn)生主動(dòng)的應(yīng)答，植物自身釋放一些小分子有機(jī)物來抵抗逆境，可溶性糖就是其中之一；轉(zhuǎn)KcERF基因的植株在可溶性糖含量方面表現(xiàn)出持續(xù)的增長狀態(tài)，說明從受到脅迫開始，轉(zhuǎn)基因植株就釋放可溶性糖來抵御逆境，比野生型在抗鹽逆境抵御方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性。

綜上所述，從秋茄中克隆出的KcERF轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性并可以顯著提高植株的耐鹽性，有維持植株正常的生理生化功能的作用。同時(shí)，我們已將KcERF基因轉(zhuǎn)到豆科牧草百脈根(Lotuscorniculatus)和棉花(Gossypiumspp.)中，以觀察其大田作業(yè)下的耐鹽能力。通過試驗(yàn)，希望能培育耐鹽牧草和棉花新品種，在我國大量的鹽堿地中加以利用。

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