李佳，劉紅燕，劉謙，張永清

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

甜地丁為我國(guó)民間傳統(tǒng)藥材，來(lái)源于豆科植物米口袋(G.verna(Geogri)A.Bor.)的干燥全草［1］，具有清熱解毒、涼血消腫的功能，臨床用于治療疔瘡、癰疽及一切化膿性炎癥，主要含有黃酮、萜、揮發(fā)油、甾醇及有機(jī)酸等成分［2］。藥理研究［3－4］表明，甜地丁黃酮具有抗氧化活性。黃海蘭等［4］對(duì)甜地丁乙酸乙酯提取物清除自由基活性成分進(jìn)行了追蹤，得到槲皮素－3－O－葡萄糖苷、芹菜素和4′，7－二羥基黃酮3種黃酮類成分，發(fā)現(xiàn)其清除自由基活性的大小主要取決于酚羥基的數(shù)目，抗氧化活性順序?yàn)殚纹に兀?－O－葡萄糖苷＞芹菜素＞4′，7－二羥基黃酮，進(jìn)一步闡明了其抗氧化活性能力與其特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。但關(guān)于其提取工藝及與抗氧化活性相關(guān)性分析未見報(bào)道。為此，本文對(duì)甜地丁黃酮提取工藝及清除羥自由基、超氧陰離子自由基的抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為該味藥材黃酮類成分的藥理活性研究及天然食品抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米口袋(G.verna(Geogri)A.Bor.)采自山東長(zhǎng)清，曬干后粉碎，過60目篩，備用。

1.1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(濟(jì)南市藥檢所提供)，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH，Sigma 公司，批號(hào):S43654－357)，試劑均為分析純;蒸餾水(自制)。

1.1.3 儀器

721型紫外－可見分光光度計(jì);FA1104型電子天平(上海天平儀器廠);HH－S4雙孔四列電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永鑫儀器廠);101－(1)A數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 甜地丁總黃酮的提取工藝

粉碎后的干燥甜地丁→加石油醚→索氏提取除脂→抽濾得濾渣→乙醇回流提取總黃酮→濃縮濾液→75%乙醇溶液定容。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取60℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.10mg，置50mL量瓶中，用80%乙醇溶解稀釋并定容至刻度。精密量取 0、1、2、3、4、5、6、7 mL 分別置于 10mL 容量瓶中，加 0.72 mol/L 的 NaNO2溶液 0.3 mL，搖勻，放置6 min;加入0.47 mol/L的Al(NO3)3溶液0.3 mL，振搖，放置6 min;再加入1 mol/L的NaOH 溶液2 mL，振搖并加水至刻度，放置15 min。全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)510 nm處有最大吸收峰，在510 nm處測(cè)吸光度，得回歸方程:A=0.0106C －0.0003(r=0.9993，n=7)，表明對(duì)照品在 10.20 ～71.40 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性。

1.2.3 正交試驗(yàn)分析

在單因素實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，條件如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)提取工藝的因素水平表Table1 Factor levels of the extraction technology of orthogonal array design

1.2.4 總黃酮含量測(cè)定

樣品各精密稱取5份，每份約0.5 g，按最佳提取工藝制備樣品供試液，含量測(cè)定按1.2.2方法進(jìn)行，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.5 總黃酮體外抗氧化活性研究

采用Fenton體系和鄰苯三酚自氧化法，對(duì)最佳條件下提取的總黃酮體進(jìn)行外抗氧化性測(cè)定。

1.2.5.1 甜地丁總黃酮對(duì)·OH清除實(shí)驗(yàn)

Fenton反應(yīng)體系是用來(lái)產(chǎn)生羥自由基(·OH)最常用的體系［5］，而·OH清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［6］。

1.2.5.2 清除超氧陰離子自由基(O2－·)的活性

參照文獻(xiàn)［7］采用鄰苯三酚自氧化法在299 nm處測(cè)定樣品對(duì)O2－·的清除能力，計(jì)算清除率。

1.2.6 甜地丁總黃酮與抗氧化活性相關(guān)性分析

以羥自由基清除率(X1)、超氧陰離子自由基清除率(X2)為橫坐標(biāo)，甜地丁總黃酮量(Y)為縱坐標(biāo)，采用SPSS16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率有顯著影響，影響程度依次為A＞D＞C＞B?？紤]到實(shí)際情況，確定最佳提取工藝為A2D3B1C1，即20倍量75%乙醇，提取4次，提取時(shí)間為30min。在此條件下的總黃酮得率為3.423%，RSD=0.16%(n=3)。

表2 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析Table 2 Orthogonal experiment and its result analysis

2.2 體外抗氧化活性研究

甜地丁總黃酮對(duì)·OH和O2－·的清除能力隨濃度的增大而增大，在濃度為45.6 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，表明甜地丁總黃酮對(duì)·OH和O2－·清除能力與濃度呈較明顯的量效關(guān)系(圖1)。

2.3 甜地丁總黃酮與抗氧化活性相關(guān)性分析

圖1 總黃酮對(duì)·OH和O2－·的清除作用Fig.1 Scavenging effects of total flavonoids to ·OH and O2－·

表3 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)表Table 3 Regression coefficient and significance analysis table

圖2 回歸標(biāo)準(zhǔn)殘差正態(tài)P-P圖Fig.2 Normal plot of regression standard residuals

把總黃酮量(Y)作為因變量，X1、X2作為自變量帶入回歸方程進(jìn)行全回歸?？傮w參數(shù)如下:相關(guān)系數(shù)為0.944，決定系數(shù)為0.890，反映了總體回歸效果較好;方差顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示F=12.183，P＜0.05，回歸標(biāo)準(zhǔn)殘差正態(tài)P-P圖(圖2)顯示自變量(Xn)與因變量(Y)服從正態(tài)分布，證明甜地丁總黃酮含量與抗氧化活性之間存在顯著的線性關(guān)系。進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行多元線性回歸分析，得到回歸系數(shù)分析表(表3)。由表3得擬合方程:Y= －18.626+2.314X1+0.514X2，標(biāo)準(zhǔn)化后，擬合方程:Y= －18.626+0.726X1+0.228X2。

4 討論

黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生理活性，且具有高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。其抗氧化作用機(jī)制主要與其特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，可以通過與金屬離子發(fā)生相互作用而具有抗氧化活性［8］，還可通過酚羥基與自由基進(jìn)行抽氫反應(yīng)生成穩(wěn)定的半醌自由基，中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［9－10］而具有抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)甜地丁中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，甜地丁總黃酮具有良好的清除·OH和O2－·的能力，表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性。由于甜地丁來(lái)源豐富，且屬于無(wú)毒無(wú)副作用的天然產(chǎn)物，故將其作為抗氧化劑開發(fā)將會(huì)具有廣闊的前景。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:附錄Ⅲ.

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