伊順仁 黃藝珠 陳景容 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

對于豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒免疫學(xué)方面的研究盡管還有許多令人期待的未知，但近年來的研究報(bào)道也有很多值得關(guān)注的內(nèi)容。文中針對豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的特異性免疫應(yīng)答在保護(hù)性免疫中的作用、免疫調(diào)節(jié)及免疫逃避等內(nèi)容做一綜述，為臨床免疫的研究應(yīng)用提供借鑒。

1 PRRSV的特異性免疫應(yīng)答

1.1 體液免疫

1.1.1 PRRSV體液反應(yīng)動力學(xué)及ADE現(xiàn)象 健康豬感染PRRSV后可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生全身性的體液免疫應(yīng)答。體液免疫由胸腺依賴性抗原和非胸腺依賴性抗原（TI）誘發(fā)［1］。一些豬在感染 PRRSV 5～7 d就可檢測到抗體，到14 d時，所有豬的血清發(fā)生轉(zhuǎn)陽［2］。特異性IgM抗體在14 d時達(dá)到高峰，然后下降，到42 d時基本檢測不到。特異性IgG抗體在感染后21～49 d達(dá)到高峰［3］。但是，這些感染早期快速產(chǎn)生的IgM、IgG并沒有中和作用，其主要作用對象是GP5和N蛋白［4-5］，結(jié)合在病毒粒子表面，可促進(jìn)病毒粒子進(jìn)入巨噬細(xì)胞。能迅速增強(qiáng)PRRSV在巨噬細(xì)胞中復(fù)制的能力，即所謂的抗體依賴性增強(qiáng)作用(Antibody-Dependent Enhancement，ADE)現(xiàn)象［4，6］。在肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中，加入一定效價的PRRSV抗體，可使PRRSV產(chǎn)量明顯增加，甚至?xí)岣?0～100倍。通過母源抗體獲得被動免疫的仔豬，一旦母源抗體水平下降至保護(hù)水平以下，PRRSV就會表現(xiàn)ADE現(xiàn)象，從而增加了仔豬的易感性。所以，亞中和水平的體液抗體反而能促進(jìn)PRRSV的感染。

Ne1son等（1994）研究了豬抗PRRSV美洲株的體液反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果顯示：最早檢測到的抗體是抗N蛋白抗體，接著是抗M蛋白抗體，然后是抗GP5蛋白抗體［7］。另有研究顯示：非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2)包含一組非中和的B表位，可能是PRRSV的免疫活性蛋白［8-9］。目前大多數(shù)診斷檢測方法主要是針對N蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，這些抗體出現(xiàn)在感染后第1周并持續(xù)幾個月，但抗體的滴度與保護(hù)力不相關(guān)。

1.1.2 PRRSV的中和抗體及其保護(hù)意義 中和抗體在抗PRRSV的保護(hù)性免疫反應(yīng)中起重要的作用。有人進(jìn)行了血清輸入實(shí)驗(yàn)，證實(shí)單獨(dú)使用中和抗體可以完全防止PRRSV感染妊娠母豬。另外，無論是仔豬還是母豬，被動輸入的中和抗體可消除病毒血癥，對感染豬輸入中和抗體后，病毒分離和RTPCR等方法不能從這些豬的淋巴器官中檢測到病毒。同樣，中和抗體對幼豬也有保護(hù)作用，能夠100%保護(hù)易感動物抵抗PRRSV病毒血癥的最低抗體滴度是1：8［10］。但由于PRRSV感染后中和抗體的產(chǎn)生比較慢而且不規(guī)則，所以中和抗體在保護(hù)機(jī)體免受PRRSV感染中所起的作用也是有限的［11-12］。

通過被動免疫產(chǎn)生的中和抗體可以使易感動物受到暫時的保護(hù)［13］。在感染后一個月內(nèi)，用常規(guī)病毒中和試驗(yàn)檢測不到中和抗體。添加新鮮的補(bǔ)體或延長病毒與血清的作用時間可以增加中和試驗(yàn)的敏感性，可在感染后9～12 d檢測到中和抗體［14］。另有研究顯示，補(bǔ)體可使中和試驗(yàn)提高一個滴度［12，15］。但是即使采用改良的病毒中和試驗(yàn)，感染后42 d中和抗體滴度依然很低，僅為1：32～1：64。歐洲株和美洲株產(chǎn)生的中和抗體，都可在感染28 d后檢測到。

有報(bào)道顯示 M、GP2a、GP3、GP4 和 GP5 上都有病毒的中和表位［5，16-20］。但在誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生方面GP5更加重要。用PRRSV GP5接種免疫豬后可誘導(dǎo)產(chǎn)生中等水平的中和抗體，盡管如此，當(dāng)用同種(或同源)毒株攻毒時，豬可被保護(hù)，僅表現(xiàn)輕微發(fā)熱，用MARC-145細(xì)胞只能從肺和縱膈淋巴結(jié)回收到病毒，攻毒 2 周后，中和抗體滴度增加到1：128［21-22］。

無論是母豬還是仔豬，中和抗體在血清中的滴度與對豬抗PRRSV感染的免疫保護(hù)作用呈正相關(guān)。向懷孕母豬體內(nèi)輸入1：8或更高滴度的抗體，可阻止仔豬病毒血癥的出現(xiàn)；輸入1：16滴度的抗體，可保護(hù)母豬免于繁殖障礙和胎盤感染；當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1：32時，則可清除病毒感染［23］。這些結(jié)果表明，如果疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生1：32的抗體滴度，則能有效地預(yù)防疾病，并且可在清除PRRSV中成為有力的手段。

1.2 細(xì)胞免疫 細(xì)胞免疫對于預(yù)防PRRSV感染具有十分重要的作用。Mo1itor等(1997)報(bào)道，PRRSV感染后不僅產(chǎn)生針對病毒多肽的以各種特異性抗體為特征的體液疫，而且還產(chǎn)生CD4+細(xì)胞增殖和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)為特征的細(xì)胞免疫［24］。一般在外周血循環(huán)中CD4+T細(xì)胞的百分比與感染豬發(fā)病的嚴(yán)重程度有直接關(guān)系，CD4+比例愈小，感染豬越有可能發(fā)生嚴(yán)重癥狀。由此看出，豬感染疾病的臨床診斷在一定程度上建立于CD4+水平上。

PRRSV感染后第4周左右出現(xiàn)抗原特異性淋巴細(xì)胞的增生，第7周左右達(dá)到高峰，第11周左右開始下降，最多可以持續(xù)3個月［25］。此增殖性反應(yīng)可被由抗CD4+和MHC-Ⅱ類抗原產(chǎn)生的抗體所抑制，說明這種反應(yīng)是依賴CD4+和T淋巴細(xì)胞的［26］。

在自然感染PRRSV的豬體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群會發(fā)生變化，外周血中的CD4+／CD8+細(xì)胞的比例會顯著降低。但是PRRSV并非總是誘導(dǎo)這樣的變化，由于毒株的來源及毒力的差異，有的甚至?xí)a(chǎn)生相反的結(jié)果［27］。Bruin等(2000)通過淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)和病毒特異性干擾素產(chǎn)生的細(xì)胞試驗(yàn)比較了PRRSV野毒接種豬、偽狂犬病病毒 (PRV)疫苗接種豬及PRRSV疫苗接種豬的細(xì)胞免疫反應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRRSV野毒接種豬可產(chǎn)生長期而強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，與PRV疫苗接種豬的細(xì)胞免疫反應(yīng)相當(dāng)。而PRRSV減毒活疫苗接種豬的細(xì)胞免疫反應(yīng)與保護(hù)性極好的PRV疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)效果相差甚遠(yuǎn)［28］。

PRRSV 的 GP2a、GP3、GP4、GP5、M、N 蛋白都能刺激T淋巴細(xì)胞的增生［29］。但是，N蛋白的作用最弱，M蛋白的作用最強(qiáng)。各種蛋白的誘導(dǎo)作用和該蛋白的濃度呈正相關(guān)。這表明M蛋白在細(xì)胞免疫中居主要地位。

2 PRRSV的免疫調(diào)節(jié)與免疫逃避

2.1 干擾素 PRRSV可以引起繼發(fā)感染，通過阻斷一種抗病毒蛋白的激活或抑制豬體內(nèi)α干擾素（IFN-α）的活性是PRRSV免疫逃避的防御機(jī)制之一。A1bina等（1998）發(fā)現(xiàn)PRRSV在肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制，而巨噬細(xì)胞和PBMC都不產(chǎn)生IFN-α［30］。Góm ez-Laguna等（2010）發(fā)現(xiàn)PRRSV可誘導(dǎo)產(chǎn)生少量IFN-α，但它在血清中的出現(xiàn)較晚，與病毒血癥的消退相吻合［31］。PRRSV感染可能干擾維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ（RIG-Ⅰ）、To11樣受體 3（TLR3）和 IPS-1（IFN-β啟動刺激因子1）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制IFN-β啟動子活性及IFN-β產(chǎn)生，減少IFN-α表達(dá)量，從而減弱固有免疫應(yīng)答，繼而影響獲得性免疫應(yīng)答（包括延緩產(chǎn)生IFN-γ和中和抗體），并最終引起病毒血癥和持續(xù)性感染［32-34］。

另有體外的研究結(jié)果表明IFN-α和IFN-β在凈化PRRSV中起重要作用。重組豬IFN-α（rpIFN-α）可以抑制PRRSV在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制并誘導(dǎo)其他抗 PRRSV 介質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄［30，34-35］。用含有豬IFN-β（swIFN-β）表達(dá)的細(xì)胞上清液孵育M arc-145細(xì)胞后再接種PRRSV，結(jié)果未出現(xiàn)細(xì)胞病變。而用不含swIFN-β的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育M arc-145細(xì)胞，則在病毒感染后出現(xiàn)細(xì)胞病變。此外用swIFN-β培養(yǎng)液孵育分離于PRRSV陰性豬的支氣管肺泡灌肺泡巨噬細(xì)胞后再接種PRRSV，用Rea1time RT-PCR測定發(fā)現(xiàn)病毒RNA載量顯著減少；這些研究結(jié)果充分表明，Ⅰ型IFN在干預(yù)PRRSV感染方面有很大潛力。

2.2 細(xì)胞因子 IFN-γ是Th1類細(xì)胞因子的典型代表，并且是促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)因子，可抑制PRRSV在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，其作用機(jī)制是能阻斷病毒蛋白的正常合成，還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生超氧負(fù)離子的能力。提示IFN-γ可以抑制PRRSV對巨噬細(xì)胞的感染。但是，低水平的IFN-γ不能消除PRRSV［36］，且在病毒感染期間影響機(jī)體免疫系統(tǒng)［37］，可以說，PRRSV持續(xù)性感染與機(jī)體有效細(xì)胞免疫應(yīng)答低下有關(guān)。

IL-1是致炎性細(xì)胞因子，參與免疫防御抗感染。Van Reeth等（2000）研究發(fā)現(xiàn)接種PRRSV后第3～10 d，感染豬肺臟產(chǎn)生高水平的 IL-1［38］。Góm ez-Laguna等（2010）發(fā)現(xiàn)感染PRRSV后，豬肺臟損傷程度、巨噬細(xì)胞數(shù)量與IL-1α表達(dá)量顯著相關(guān)［31］。Labarque等（2003）發(fā)現(xiàn)在感染后第9 d IL-1產(chǎn)量達(dá)到峰值，而未感染PRRSV的細(xì)胞凋亡數(shù)量急劇上升［39］。因此，IL-1可能介導(dǎo)PRRSV感染后的病理發(fā)生。

IL-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞因子之一。Rompato等（2006）用IL-2表達(dá)質(zhì)粒作為PRRSV ORF7DNA疫苗佐劑給豬免疫，經(jīng)過二免后攻毒發(fā)現(xiàn)，IL-2能明顯提高T細(xì)胞增殖［40］。Xue等（2004）用IL-2作為PRRSV ORF5和ORF7疫苗的佐劑一起免疫豬，然后用同型PRRSV攻毒，發(fā)現(xiàn)豬血清、PAM和淋巴組織中病毒載量明顯減少［41］?？梢?，應(yīng)用IL-2作為PRRSV疫苗佐劑有非常不錯的前景。

IL-6與豬的細(xì)胞免疫可能有關(guān)。Liu等（2009）發(fā)現(xiàn)8周齡的豬感染PRRSV后第7 d，豬肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量 IL-6［42］。A1bina等（1998）報(bào)道，8 周齡的豬感染PRRSV后第3周，CD8+T細(xì)胞和IgM顯著增多［30］。CD8+T細(xì)胞能殺傷表達(dá)抗原的靶細(xì)胞，它是抗病毒感染的重要效應(yīng)細(xì)胞。IL-6誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞大量增殖，對于清除PRRSV感染有潛在作用。

IL-8是病毒急性感染后免疫防御機(jī)制的一部分。Aasted等（2002）發(fā)現(xiàn)經(jīng)子宮感染PRRSV的小母豬在2～6周時，血液中檢測不到IL-8，且巨噬細(xì)胞減少；這可能是由于PRRSV復(fù)制導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能受損，使生成IL-8水平降低。因而血液循環(huán)中的IL-8水平可能反映巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)［43］。Ait-A1i等（2007）研究發(fā)現(xiàn)感染PRRSV 2 h后，長白豬和皮特蘭豬的肺泡巨噬細(xì)胞中IL-8水平急劇升高，隨后IL-8水平穩(wěn)步升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，累積高水平IL-8能使PRRSV減少或延遲復(fù)制［44］。由此可見，IL-8參與豬機(jī)體抵御PRRSV感染過程。

IL-10對PRRSV的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)起很重要的作用。不論是感染PRRSV歐洲株還是美洲株，豬外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中IL-10的mRNA水平均得到了提高，且支氣管肺泡灌洗液中IL-10的濃度也增加了［45］。某些歐洲株能夠在陰性豬的PBMCs中誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的IL-10反應(yīng)，表明這是一種非記憶特性的［15］。接種IL-10誘導(dǎo)型毒株的豬，其特異性IFN-γ的分泌頻率要低于接種非IL-10誘導(dǎo)型毒株的豬，這表明IL-10的產(chǎn)生可能是PRRSV感染后體液免疫受到一定抑制的原因之一［46］。給PRRSV血清陰性豬接種PRRSV之前轉(zhuǎn)染IL-10 mRNA，PBMCs內(nèi)IL-10和IL-12 mRNA顯著減少，而IFN-γmRNA升高，TNF-α和IL-4 mRNA沒有變化。這表明外源的IL-10 mRNA可以干擾PRRSV感染后IL-10 mRNA 的表達(dá)［47］。

PRRSV感染后對IL-12表達(dá)的影響，目前相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果并不一致。有研究結(jié)果指出，PRRSV能刺激機(jī)體產(chǎn)生少量IL-12，但表達(dá)水平很弱［48-51］。

體外研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，不論在mRNA還是在蛋白水平，PBMCs感染PRRSV后表達(dá)的IL-12量也非常少［52］。但PRRSV感染豬的樹突狀細(xì)胞（DCs）中IL-12水平增高［53］，感染PRRSV后第48 h，豬DCs中IL-12的濃度大約是紫外線滅活PRRSV處理的DCs中IL-12濃度的2.7倍，提示PRRSV對不同組織細(xì)胞內(nèi)的IL-12的影響不同。

IL-18能在免疫活性細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ、GMCSF、TNF-α和IL-1等細(xì)胞因子，其中以刺激產(chǎn)生IFN-γ的能力最為顯著，它和IL-12共同協(xié)調(diào)刺激釋放IFN-γ。近來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-18有潛在促進(jìn)PRRSV免疫的作用。Shen等（2007）給小豬接種rFPV-IL-18后攻擊PRRSV，接種rFPV-IL-18的小豬產(chǎn)生的中和抗體水平、IFN-γ量和T淋巴細(xì)胞免疫增殖反應(yīng)高于對照組，這表明IL-18在某種程度上能有效提高機(jī)體產(chǎn)生PRRSV特異的體液免疫和細(xì)胞免疫［54］；但目前沒有內(nèi)源性IL-18參與PRRS免疫調(diào)節(jié)的研究結(jié)論。

GM-CSF可促進(jìn)DCs、中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞成熟，活化成熟粒細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞衍生的DCs、郎格罕氏細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞。Wang等（2009）構(gòu)建出融合表達(dá)PRRSV GP3及GP5與GM-CSF的重組腺病毒，給豬免疫rAd-GF35（含 GM-CSF）后所產(chǎn)生的 PRRSV GP3／GP5 的特異抗體水平明顯高于無GM-CSF組對照豬，PBMCs中PRRSV增殖指數(shù)明顯高于對照組［48］。提示GM-CSF能明顯增強(qiáng)豬體針對PRRSV的體液免疫和細(xì)胞免疫。

TNF-α是活化的巨噬細(xì)胞、DC和T細(xì)胞早期分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可協(xié)同IFN-γ抵抗病毒感染細(xì)胞，但它在PRRSV感染后處于受抑制狀態(tài)。Murtaugh等（2002）發(fā)現(xiàn)感染PRRSV后，豬肺臟中TNF-α表達(dá)受抑制或表達(dá)量明顯減少，并且抑制病毒復(fù)制的能力減弱，導(dǎo)致宿主針對PRRSV的免疫應(yīng)答減弱，使呼吸道出現(xiàn)PRRS亞臨床癥狀，還能引起機(jī)體持續(xù)感染 PRRSV［33］。Subramaniam 等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，在體外感染PRRSV后，PBMCs的TNF-α轉(zhuǎn)錄被抑制，細(xì)胞內(nèi)也未測到TNF-α蛋白［55］。TNF-α的表達(dá)與病毒復(fù)制呈明顯的負(fù)相關(guān)，感染后12h病毒復(fù)制達(dá)到高峰，而TNF-α水平最低。TNF-α表達(dá)水平低可能是PRRSV逃逸宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制之一［31］，因此，促進(jìn)內(nèi)源性TNF-α的表達(dá)有助于豬體抗PRRSV感染。

TNF-β的表達(dá)水平可能與PRRSV致病力有一定相關(guān)性。有報(bào)道指出，豬接種PRRSV美洲株2周后PBMCs中TNF-β和IL-10基因表達(dá)提高［52］，而豬感染PRRSV歐洲株后，PBMC中TNF-β水平無顯著變化，但是IL-10水平提高［12］。同樣，在感染PRRSV歐洲株的DCs中未能檢測到TNF-β，而感染美洲株的DCs中TNF-βmRNA表達(dá)提高［56］。由于美洲型PRRSV株的致病力一般高于歐洲型毒株，上述2個研究小組的發(fā)現(xiàn)，提示TNF-β與PRRSV病理發(fā)生有一定的相關(guān)性，PRRSV的致病力對TNF-β的影響仍待進(jìn)一步深入研究。

2.3 抗原提呈 PRRSV可能會干擾正確的抗原提呈和T淋巴細(xì)胞的活化。PRRSV能下調(diào)樹突細(xì)胞(DCs)中主要組織相容性復(fù)合體MHC-Ⅰ的表達(dá)，不過這與混合型白細(xì)胞反應(yīng)中增值反應(yīng)的減弱無關(guān)［35］。當(dāng)PRRSV感染激活單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞時，CD11b/c、CD14、CD80/86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達(dá)均下調(diào)［57-58］，用滅活的PRRSV時則沒有下調(diào)。同時，當(dāng)受感染的樹突細(xì)胞與同源的或同種異體的淋巴細(xì)胞配套使用時，增值反應(yīng)減弱，由此表明受感染的樹突細(xì)胞抗原提呈能力下降［58］。PRRSV能夠通過改變樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子類型，以及通過改變參與抗原提呈的分子的表達(dá)，從而減弱獲得性免疫應(yīng)答。

2.4 GP5的誘騙表位和糖基化位點(diǎn) GP5蛋白胞外結(jié)構(gòu)域氨基端高度糖基化，并與M蛋白形成異原二聚體［59-60］，用反向免疫法和其他涉及重疊蛋白的研究證實(shí)GP5主要中和位點(diǎn)與中和抗體的活動相關(guān)，這個位點(diǎn)的最小抗原區(qū)域在33～47位氨基酸，已被確認(rèn)是中和表位的核心區(qū)域［13，61-63］，這個核心區(qū)域被稱做B位點(diǎn)，此中和位點(diǎn)在糖基化位點(diǎn)的側(cè)面。GP5的另一個優(yōu)勢顯性表位A位點(diǎn)，位于GP5氨基末端的胞外域(第27～31位氨基酸處)，具有誘騙表位的特性，與人HIV-1中的Decoy相似［13］。Decoy位點(diǎn)是導(dǎo)致中和位點(diǎn)免疫反應(yīng)性降低的毗鄰于中和位點(diǎn)的位點(diǎn)?？刮稽c(diǎn)A的抗體在PRRSV感染早期被誘導(dǎo)產(chǎn)生，而在感染后前30 d不能檢測到抗 B 位點(diǎn)的抗體［63-64］。

因此，認(rèn)為A位點(diǎn)與中和B位點(diǎn)的同時出現(xiàn)將抑制對中和位點(diǎn)B的反應(yīng)?？怪泻臀稽c(diǎn)B的抗體的延遲產(chǎn)生可以解釋早期研究者所描述的無中和抗體產(chǎn)生的原因，因此，中和抗體延緩產(chǎn)生是PRRSV逃逸免疫監(jiān)視的主要機(jī)制，也是PRRSV感染的主要特征。

但是，誘騙表位不是PRRSV逃避體液免疫的唯一方式。GP5蛋白含有4個糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位于或靠近中和位點(diǎn)內(nèi)。在受感染豬中，上游高變區(qū)缺失糖基化位點(diǎn)的美洲分離株與下游N-44位缺失糖基化位點(diǎn)的毒株相比，產(chǎn)生中和抗體的能力快速而且強(qiáng)烈［65］。西班牙分離株在1991-2005年的進(jìn)化過程中呈現(xiàn)出一個趨勢，即N-46(相當(dāng)于美洲株的N-44位置)糖基化位點(diǎn)逐漸消失，而在側(cè)面(N-37和N-53)保持或獲得新的糖基化位點(diǎn)，這與誘導(dǎo)較弱的中和抗體毒株是一致的［66］。

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