鳳 婷， 趙密珍， 王 鈺， 夏 瑾， 孟憲鳳

(1.安徽大學資源與環(huán)境工程學院，安徽 合肥 230601;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，江蘇 南京 210014)

草莓品種寧玉是江蘇省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所選育，于2010年通過江蘇省品種委員會鑒定的新品種，該品種早熟，果實圓錐形、果型端正、色澤艷麗、風味甜香，植株抗病性強、耐低溫性好，為優(yōu)良的設施栽培專用新品種［1］。針對這樣的優(yōu)良品種，如果能建立其再生體系，可以為今后進一步利用與研究奠定基礎［2-3］。

由于草莓葉片、葉柄取材方便，便于攜帶和保存，早在20世紀80年代國外學者就開展了草莓葉片再生［4-5］的研究，中國很多研究者［6］也均通過試驗建立了不同品種草莓葉片及葉柄再生體系［7-9］，均發(fā)現(xiàn)不同品種再生效率差距很大［10-11］。為此，本試驗研究不同因素對寧玉再生的影響，旨在為寧玉再生體系的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

寧玉為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院園藝所組培室培養(yǎng)的組培苗，選取轉(zhuǎn)接45 d左右的健壯植株，扯下由內(nèi)而外第3～7片幼嫩翠綠完全舒展開的葉齡在10～40 d左右的葉片，同時剪下所選葉片的葉柄，一起作為試驗材料。

1.2 不定芽的誘導

1.2.1 激素組合的選擇 將基本培養(yǎng)基定為MS(蔗糖30.0 g/L，瓊脂6.2 g/L)+TDZ(2.0 mg/L)，在基本培養(yǎng)基上添加不同濃度的吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IAA)3種生長素，以基本培養(yǎng)基為對照，共10個組合?；九囵B(yǎng)基與 IBA組合:IBA濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L?；九囵B(yǎng)基與NAA組合:NAA濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L?；九囵B(yǎng)基與IAA組合:IAA 濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。

將生長狀態(tài)一致的葉片剪成邊長約4 mm左右的正方形，接入培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.2.2 再生部位的比較 將生長狀態(tài)一致的葉片剪成邊長約4 mm左右的正方形，葉柄剪成長約1 cm左右的條狀，中間用手術(shù)刀片切割3～4道傷口(不能切斷)，將葉柄和葉片一起放進MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，外面一圈葉片，里面一圈葉柄，可以直觀的比較葉片和葉柄的誘導能力。每隔10 d觀察試驗結(jié)果，30 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.3 暗培養(yǎng)時間的篩選 將接種后的葉片和葉柄放進組培室黑箱中進行5 d、10 d、15 d、20 d的暗培養(yǎng)，直接光培養(yǎng)的作為空白對照。暗培養(yǎng)結(jié)束后放到正常光下培養(yǎng)，接種后30 d統(tǒng)計不同暗培養(yǎng)時間處理的誘導結(jié)果。

1.2.4 葉齡的篩選 分別選取葉齡為10 d、20 d、30 d、40 d左右的葉片做為材料，同上剪切后正面朝上放進同一瓶MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種30 d后比較不同葉齡葉片的誘導結(jié)果。

1.2.5 放置方式的比較 選取最佳誘導葉齡的葉片剪切后以不同方式(一半葉片剪切后正面向上接到外一圈，另一半剪切后反面向上接到內(nèi)一圈)放進同一瓶培養(yǎng)基，接種30 d后觀察葉片不同放置方式對芽誘導的影響。

1.2.6 培養(yǎng)條件與統(tǒng)計方法 本試驗各處理均接種10瓶，每瓶10個葉片(柄)，重復3次，放到組培室［光照度3 000 lx，光照14 h/d，溫度(25±2)℃］進行恒溫培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計不定芽的誘導率。

葉片不定芽誘導率=長出不定芽的葉片總數(shù)/接種的葉片總數(shù)×100%;

葉柄不定芽誘導率=長出不定芽的葉柄總數(shù)/接種的葉柄總數(shù)×100%。

1.3 生根及移栽

將上述試驗中的再生芽做生根培養(yǎng)的試驗材料。

第一步:基本培養(yǎng)基的選取。配MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基。將再生芽剪下接種，進行生根培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計生根率、平均每株生根條數(shù)及根須長度，選出生根最佳基本培養(yǎng)基。

第二步:將第一步篩選出的培養(yǎng)基定為基本培養(yǎng)基，進行添加激素試驗，探索最佳生根培養(yǎng)基的最佳激素組合。選取IBA、NAA以及IAA 3種生長素分別與基本培養(yǎng)基進行不同量組合，以基本培養(yǎng)基為對照，共10個組合?；九囵B(yǎng)基與IBA組合:IBA濃度分別為 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L?；九囵B(yǎng)基與 NAA組合:NAA濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。基本培養(yǎng)基與IAA組合:IAA濃度分別為 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。

將各組合調(diào)pH到5.8，放到組培室［光照度3 000 lx，光照14 h/d，溫度(25±2)℃］進行恒溫培養(yǎng)。每個處理接種5瓶，每瓶接種10株再生芽，重復3次。30 d后統(tǒng)計生根情況。

再生苗根部生長至4 cm左右時開啟封口膜，往瓶內(nèi)注入2 ml自來水后于室溫下煉苗1 d。然后用鑷子夾出于自來水龍頭下洗凈粘附的培養(yǎng)基，去掉外面一層老葉整理干凈后栽到36格的營養(yǎng)缽中，將水澆透基質(zhì)，放進大棚，以后1 d澆1次水保持基質(zhì)充分濕潤，14 d后統(tǒng)計成活率。

2 結(jié)果

2.1 不同激素組合的誘導效果

從不同激素組合誘導的結(jié)果顯示:在IBA、NAA、IAA 3種激素中，NAA的誘導效果最好，另外2種激素的誘導效果無明顯差異;對于同一種激素來說，激素添加量過少，誘導效率較低，但是添加量過高，誘導率增加不明顯，玻璃化苗的機率大大增加。綜合各結(jié)果:添加0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基誘導效果最好。

2.2 再生部位

從試驗結(jié)果可以看出，葉柄出芽時間早于葉片，其誘導率高于葉片，說明葉柄再生能力強于葉片。從傷口的愈傷情況可以看出葉片和葉柄的基部誘導能力均高于葉頂部，誘導能力從強到弱依次為葉柄基部＞葉片基部＞葉片頂部＞葉柄頂部。

2.3 暗培養(yǎng)時間

從幾種不同暗培養(yǎng)時間的外植體生長情況來看，10 d是最佳的暗培養(yǎng)時間，外植體誘導率達到50%。0 d、5 d的暗培養(yǎng)時間過短，葉片幾乎不分化而且直接褐化枯萎，誘導率為零;15 d、20 d暗培養(yǎng)時間太長，誘導率不高，分別為24%和17%。

2.4 葉齡

從試驗過程和結(jié)果來看，葉齡太小，不僅操作麻煩，難以修剪，而且分化率低，10 d大小的葉片葉面積太小，剪切不利，沒有分化。30 d葉齡葉片誘導率只有12%，40 d葉齡葉片誘導率不高，在10%以下。20 d葉齡的葉片分化效果最佳，為46%。由此可見，葉齡過小、過大都不利于誘導，20 d葉齡大小合適，誘導活力最強，這可能與20 d時葉片中的激素水平適中有關(guān)。

2.5 放置方式

通過比較葉片的2種放置方式得出，正面朝上的放置方式誘導率達到52%，反面朝上放置方式的誘導率只有31%，這與很多文獻所得出的結(jié)果基本一致。很多學者認為原因是葉片下表面氣孔較多，與培養(yǎng)基接觸容易從培養(yǎng)基中吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)，所以正面朝上比較容易誘導再生。

2.6 生根培養(yǎng)基

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):1/4MS培養(yǎng)基中再生芽最早生根，14 d時根須多而且長，平均每株生4～8條根須;MS培養(yǎng)基中生長的根系較粗壯，但是伸長速度較慢;1/2MS培養(yǎng)基中再生芽的生根速度及根須數(shù)皆不如1/4MS培養(yǎng)基。1/4MS培養(yǎng)基中組培苗株高不如MS培養(yǎng)基，但是移栽后發(fā)現(xiàn)1/4MS培養(yǎng)基的組培苗長勢和MS培養(yǎng)基無顯著差異，估計是生根后期營養(yǎng)的缺失導致。綜合各因素，選取1/4MS培養(yǎng)基為最佳生根基本培養(yǎng)基。

在上述選取的最佳基本培養(yǎng)基基礎上，進行添加激素試驗，25 d后統(tǒng)計分析結(jié)果得出:生根率均可達到100%;但是IAA添加濃度為0.2 mg/L時生根較早，同時，在添加IAA培養(yǎng)基中，植株的根長、株高均優(yōu)于添加IBA培養(yǎng)基;添加NAA的培養(yǎng)基，生根數(shù)量較多，植株高，但是極易長出白色瘤狀物質(zhì)，綜合以上結(jié)果得出:生根培養(yǎng)基成分可確定為:1/4MS+IAA(0.2 mg/L)。

2.7 移栽后成活率

移栽14 d后觀察發(fā)現(xiàn)大部分再生苗植株長高，葉片長大、增多，情況良好，成活率達到97.22%。添加IAA組合再生苗移栽后長勢最好，添加NAA組合死苗很多，添加IBA組合草莓苗瘦弱矮小，長勢不佳。

3 討論

綜合本試驗結(jié)果可得出:草莓品種寧玉不定芽再生最佳培養(yǎng)基是 MS(蔗糖 30 g/L，瓊脂 6.2 g/L)+TDZ(2.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L);葉片及葉柄基部誘導能力最強;10 d左右是暗培養(yǎng)最佳時間;20 d葉齡的葉片是最佳誘導材料;葉片正面朝上比反面朝上放置方式好;最佳生根培養(yǎng)基為1/4MS+IAA(0.2 mg/L);生根率可達到100%;煉苗移栽后成活率可達到97.22%。

本試驗利用TDZ激素誘導再生，雖然再生率不低，但是有文獻曾報道:TDZ的過度使用會增加產(chǎn)生玻璃化苗的風險，該試驗過程中確實有小部分玻璃化苗出現(xiàn)，所以后續(xù)工作剔除玻璃化苗是關(guān)鍵步驟。

將葉片和葉柄一同培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)葉柄誘導芽的能力比葉片強，這與很多參考文獻中提到的葉片誘導能力較強，葉柄比葉片容易誘導出愈傷組織，但不易直接誘導出芽［12］的結(jié)果不一致，這可能是基因型不同造成的，具體原因還需進一步探討。本試驗結(jié)果也表明葉柄和葉片基部誘導能力均強于頂部。

有很多研究結(jié)果表明，在IBA，NAA，IAA 3種生長素中，IBA誘導再生能力比NAA強［13］，而在本試驗結(jié)果中，誘導能力最強的是NAA，IAA較弱，最差的是IBA，其具體原因有待進一步研究。

一些研究結(jié)果表明:再生過程中，暗培養(yǎng)后放到光下培養(yǎng)，如果外植體褐化無綠色而且無膨大現(xiàn)象，基本可以肯定是誘導失敗。但本試驗品種寧玉在誘導過程中，出現(xiàn)上述現(xiàn)象后，仍然具有很強的再生活力。由此可以證明該品種確實是抗性很強的優(yōu)良品種，具體原因需以后從分子學層面深入探討。

［1］趙密珍，王壯偉，錢亞明，等.草莓新品種“寧玉”［J］.園藝學報，2011，38(7):1411-1412.

［2］秦永華.豐香草莓高效再生的機理及遺傳轉(zhuǎn)化研究［D］.杭州:浙江大學，2005.

［3］吳雪梅，湯浩茹.草莓葉片培養(yǎng)研究進展［J］.果樹學報，2004，21(6):598-602.

［4］NEHRA N S，STUSHNOFF C，KARTHA K K.Direct shoot regeneration from strawberry leaf disks［J］.Journal America Hort-Science，1989，114(6):1014-1018.

［5］NEHRA N S，CHIBBAR R N ，KARTHA K K.Agrobacterium mediated transformation of strawberry calli and recovery of transgenic plants［J］.Plant Cell Repors，1990，9:10-13.

［6］閆華曉，趙 輝，崔德才.影響草莓葉片植株再生因素的研究［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報，2003，34(2):177-180.

［7］NEHAR N S，STASHNOFF C，KARRHA K K.Regeneartion of plant from immature leaf-derived callus of strawberry(Fragaria anannassa)［J］.Plant Cell ReP，1990，66(1):119-126.

［8］NRHAR N S ，STASHNOFF C.Direct shoot regeneration from strawberry leaf disks［J］.J Amer Soc Hort Sci，1989，114(6):1014-1018.

［9］馮 利.草莓“紅頰”快速繁殖及遺傳轉(zhuǎn)化體系研究與應用［D］.杭州:浙江大學，2011.

［10］孫崇波，謝 鳴，蔣桂華，等.草莓主栽品種豐香高效再生體系的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2003，15(2):69-72.

［11］KATI H，HARRI K，SIRPA K.Shoot regeneration from leaf explants of five strawberry(Fragaria×Ananassa)cultivars in temporary immersion bioreactor system［J］.Society for In Vitro Biology，2005，41:826-831.

［12］GREENE A E ，DAVIS T M.Regeneration of Fragaria vesca plants from leaf tissue［M］.Portland Oregon，USA:Dale A and Luby J J，1991.

［13］王 翡，高志紅，章 鎮(zhèn)，等.草莓高效離體葉片再生體系的建立［J］.西北植物學報，2010，30(5):1045-1049.