吳利俊(綜述) 劉 杰(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院消化科 上海 200040)

鈣離子依賴型凝集素受體超家族成員之一——鈣離子依賴型凝集素樣受體2(calcium-dependent lectin-like receptor 2，CLEC-2)是近年發(fā)現(xiàn)的血小板表面受體，相對分子質(zhì)量(Mr)約32 000，屬于Ⅱ型跨膜受體，主要介導(dǎo)血小板聚集和活化效應(yīng)［1］。蛇毒蛋白Rhodocytin和唾液酸樣糖蛋白Podoplanin是目前被分別鑒定出的CLEC-2的外源性和內(nèi)源性配體。CLEC-2與配體相互作用對于血栓形成和維持粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性至關(guān)重要［2］。同時(shí)，Podoplanin 與CLEC-2結(jié)合后可通過活化血小板后促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展［3］。此外，CLEC-2的抗血清還能阻斷HIV-1與血小板的結(jié)合，而血小板又參與了呈遞HIV-1至靶細(xì)胞，繼而感染宿主細(xì)胞的過程，提示CLEC-2可能參與血小板捕獲HIV-1的過程［4］?；贑LEC-2與多種疾病的相關(guān)性，阻斷其與配體相互作用可能是治療上述疾病的新方法。本文就CLEC-2及其與腫瘤等疾病的關(guān)系作簡要綜述。

CLEC-2的結(jié)構(gòu)與功能

CLEC-2的來源和表達(dá) CLEC-2屬于鈣離子依賴型凝集素受體超家族一員，該家族至少含有70種人類跨膜蛋白，含有鈣離子依賴型結(jié)構(gòu)域(C-type lectin like domain，CTLD)，共分為 14 個組［1］。而按照是否含有鈣離子和糖類識別位點(diǎn)共有序列，又可將該家族分為典型和非典型兩大類。CLEC-2屬于第5組非典型凝集素樣受體。

CLEC-2的編碼基因位于12號染色體，其相對分子質(zhì)量為32 000。CLEC-2最早從人骨髓細(xì)胞內(nèi)被克隆出來，其cDNA最早被報(bào)道是選擇性表達(dá)在肝細(xì)胞和一些骨髓來源血細(xì)胞上，如單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞上［5］。最近發(fā)現(xiàn)CLEC-2在血小板表面也有表達(dá)［6］。

CLEC-2的結(jié)構(gòu)特征 CLEC-2屬于Ⅱ型跨膜受體，其跨膜區(qū)由41個氨基酸構(gòu)成，胞質(zhì)尾區(qū)由31個氨基酸構(gòu)成，包含3個重要結(jié)構(gòu):一個YXXL序列、21和27位兩個保守的絲氨酸序列、9位部分保守的蘇氨酸序列，其中YXXL序列對于CLEC-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程非常重要。CLEC-2調(diào)節(jié)Syk就是通過在血小板表面形成二聚體，每個Syk具有的兩個串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域分別與CLEC-2胞質(zhì)內(nèi)尾巴上的單個磷酸化YXXL序列結(jié)合，即CLEC-2與Syk以2∶1形式結(jié)合。CLEC-2以這種二聚體形式來介導(dǎo)血小板活化與聚集等效應(yīng)［7］。

CLEC-2的配體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

外源性配體Rhodocytin 蛇毒蛋白Rhodocytin，也稱Aggretin，是同時(shí)被兩個實(shí)驗(yàn)室從蝰蛇的毒液中純化出來的一種蛋白［8－9］。Rhodocytin 以 60 000(αβ)2四聚體形式存在，αβ亞基共享39%同源序列，每個亞基都具有典型的C型凝集素樣折疊特征，具有兩個反平行β折疊，兩個α螺旋側(cè)翼。Aggretin具有很強(qiáng)的活化血小板的功能，但在引發(fā)血小板聚集前，有一段延遲滯后時(shí)間，但隨著蛋白濃度的增加，延遲時(shí)間縮短［8－9］。最初認(rèn)為該蛋白也是通過整合素α2β1或者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但Rhodocytin缺乏陽離子共作用殘基，并不能與糖類相互作用，后來被證實(shí)該過程是通過CLEC-2來實(shí)現(xiàn)的［10］。

CLEC-2表面結(jié)合位點(diǎn)是一個長環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，而Rhodocytin四聚體則包含兩個由αβ異二聚體構(gòu)成的凹陷結(jié)合表面，因此，能夠同時(shí)適應(yīng)兩個CLEC-2分子聚合定位產(chǎn)生二聚體。同樣，Rhodocytin四聚體結(jié)構(gòu)還能保護(hù)CLEC-2分子處于靜電和疏水效應(yīng)均優(yōu)化的位置，配體與受體結(jié)合以后能夠促發(fā)血小板表面CLEC-2的高度有序聚合，引起強(qiáng)烈的血小板聚集效應(yīng)［11］。

內(nèi)源性配體Podoplanin Podoplanin(Aggrus)是I型跨膜唾液酸樣糖蛋白，包含一個富含Ser/Thr殘基的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，這些殘基是潛在的原位多聚糖位點(diǎn)，以及一個單一的跨膜部分和一個短的胞質(zhì)內(nèi)尾巴，該尾巴含有的YXXL模塊可能是蛋白激酶C(PKC)和cAMP磷酸化位點(diǎn)［3，12－13］。Podoplanin 在很多腫瘤細(xì)胞上都存在高表達(dá)現(xiàn)象，包括鱗狀細(xì)胞癌、睪丸精原細(xì)胞瘤和腦腫瘤［14］。Podoplanin在腎小球上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)以及在I型肺泡細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上豐富表達(dá)［15－16］。Podoplanin缺陷鼠在出生時(shí)即死亡，因?yàn)楹粑ソ咭约傲馨腿毕?，提示Podoplanin在淋巴管形成過程中非常重要［17］。

CLEC-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 CLEC-2與配體結(jié)合以后，調(diào)控活化信號依賴蛋白酪氨酸磷酸化，包括酪氨酸激酶Src、Syk、適配體蛋白SLP-76以及PLCγ2。即CLEC-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過Src、Syk依賴?yán)野彼峒っ?，使得一系列適配體和效應(yīng)蛋白發(fā)生磷酸化，累積激活PLCγ2和血小板活化。該過程與GPⅥ介導(dǎo)的血小板聚集不同，CLEC-2是以二聚體形式發(fā)揮作用，激活Syk僅是通過胞質(zhì)尾巴內(nèi)的單個YXXL序列，僅是部分依賴適配體蛋白SLP-76，與另外兩種凝集素受體類似，即 Dectin-1、CLEC9A［11，18］。Podplanin 與 CLEC-2結(jié)合后能夠引起多個CLEC-2分子的胞質(zhì)信號段靠近，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與CLEC-2和Rhodocytin作用過程相似。

CLEC-2與疾病的關(guān)系

CLEC-2與血栓性疾病 血管壁完整性的損傷會導(dǎo)致內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的暴露，激活血小板和促進(jìn)聚集，這是止血的初始過程。CLEC-2缺陷能夠?qū)е鲁鲅獣r(shí)間延長和保護(hù)免受動脈閉塞癥血管內(nèi)血栓形成的威脅。在血管損傷部位，多個血小板受體/配體相互作用信號途徑協(xié)同作用，確保血循環(huán)內(nèi)有效的血小板黏附和血栓形成，而CLEC-2依賴信號途徑對于維持血循環(huán)內(nèi)血栓及斑塊的穩(wěn)定性至關(guān)重要［19］。粥樣硬化斑塊破裂可導(dǎo)致動脈閉塞和栓子形成，引起心梗和卒中，因此抑制血小板功能能夠預(yù)防和治療缺血性心腦血管疾病。

CLEC-2與腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展 Sugimoto等［20］早期使用單克隆抗體8F11抑制鼠高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸腺癌26細(xì)胞株肺轉(zhuǎn)移的研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移克隆株，即變異株 NL-17，能夠表達(dá)更多的Podoplanin(Aggrus)并誘導(dǎo)大量血小板聚集，而抗Aggrus抗體8F11則能夠抑制血小板聚集，且減少結(jié)腸腺癌在肺部的定植。隨后，在結(jié)腸癌患者中也發(fā)現(xiàn)Aggrus在癌組織中的表 達(dá) 明 顯 高 于 癌 旁 組 織［12］。Podoplanin/CLEC-2依賴的血小板聚集具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，可能是通過形成“血小板帽”結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受機(jī)械力影響。但是它們的相互作用并非局限于幫助腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，活化的血小板還能夠釋放很多儲存在血小板內(nèi)的細(xì)胞因子，包括血管內(nèi)皮生長因子、血小板趨化生長因子和鞘氨醇1-磷酸。這些細(xì)胞因子可能與血小板表面黏附分子共同參與腫瘤新生血管形成，從而促進(jìn)腫瘤生長。因此，阻斷Podoplanin和CLEC-2的相互作用可能是阻止腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的一個靶點(diǎn)。

CLEC-2與HIV-1感染 血小板能夠表達(dá)細(xì)胞表面黏附分子，與HIV-1相互作用后使病毒集中在細(xì)胞表面，增加包膜蛋白與CD4和輔助受體的結(jié)合機(jī)會，并且保持病毒的感染力持續(xù)數(shù)天，從而增強(qiáng)病毒感染力，尤其是當(dāng)病毒受體表達(dá)處于低水平的時(shí)候［21］。HIV-1與血小板結(jié)合活性一定程度上能夠被CLEC-2的抗血清所抑制，提示CLEC-2參與血小板捕獲HIV的過程［22］。HIV-1與CLEC-2的相互作用能夠誘導(dǎo)血小板活化，導(dǎo)致反式感染和病毒退化，影響病毒感染和疾病進(jìn)展。此外，CLEC-2在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞上也有表達(dá)，這些細(xì)胞對HIV都是易感的。因此，CLEC-2可能參與調(diào)節(jié)HIV-1在感染者體內(nèi)的傳播。血小板能夠同時(shí)表達(dá)DC-SIGN和CLEC-2，但是這兩種蛋白是通過不同機(jī)制來捕獲HIV-1，前者直接結(jié)合到HIV-1包膜蛋白，而CLEC-2是通過識別一種結(jié)合在病毒顆粒上的宿主細(xì)胞因子。HIV-1與CLEC-2作用過程可能是通過目前未被鑒定的CLEC-2的內(nèi)源性配體來介導(dǎo)［23］，而并非已知的Podoplanin，因?yàn)镻odoplanin在HIV-1最主要的靶細(xì)胞——變異 T細(xì)胞上并無表達(dá)。雖然Podoplanin可能并不直接介導(dǎo)HIV-1捕獲過程，但是其在很多腫瘤，包括Kaposi肉瘤中有高表達(dá)現(xiàn)象［24］，提示 Podoplanin可能參與 AIDS相關(guān) Kaposi肉瘤的進(jìn)展而不是調(diào)節(jié)HIV-1在體內(nèi)的傳播過程。

CLEC-2未來研究方向 關(guān)于CLEC-2及配體在生理狀態(tài)下的相互作用仍不清楚。近來有研究表明CLEC-2在滋養(yǎng)細(xì)胞上也有表達(dá)，該分子可能參與滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為，維持正常妊娠的穩(wěn)態(tài)，且有可能是通過ERK、JNK信號途徑來調(diào)控［25］。因此，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CLEC-2更多的生理功能也是重要的研究方向，如更多的內(nèi)源性或外源性配體及其相互作用等。此外，前述多種疾病均與CLEC-2存在相關(guān)性，但是目前機(jī)制并不明確，如血小板通過何種內(nèi)源性配體來實(shí)現(xiàn)捕獲HIV-1、人體中CLEC-2表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系如何等。因此，深入探討這些問題，能夠?yàn)轭A(yù)防和治療相關(guān)疾病提供新思路。

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