楊詩(shī)舟 凌志強(qiáng) 李沛 董子明 季文豪 毛偉敏

食管鱗癌組織中miR-129與患者預(yù)后的關(guān)系分析

楊詩(shī)舟 凌志強(qiáng) 李沛 董子明 季文豪 毛偉敏

目的 研究miR-129在食管鱗癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異及其與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、分化程度及患者無(wú)病生存期的關(guān)系。 方法 提取106例患者食管鱗癌組織和癌旁組織標(biāo)本中的總RNA，應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)兩者miR-129的表達(dá)差異。 結(jié)果 106例食管鱗癌標(biāo)本中，有36例(33.9%)出現(xiàn)了不同程度的miR-129表達(dá)上調(diào)，另有58例（54.7%）出現(xiàn)了miR-129的表達(dá)下調(diào)。男性、有飲酒史的患者癌組織中miR-129表達(dá)水平明顯高于女性、不飲酒者（P＜0.05），miR-129相對(duì)表達(dá)的升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、分化程度均存在相關(guān)性（均P＜0.05）。miR-129表達(dá)升高的患者無(wú)病生存期較表達(dá)不高的患者縮短（P＜0.01），miR-129相對(duì)表達(dá)水平、腫瘤分化程度和性別是影響食管鱗癌患者生存的因素（P＜0.05）。 結(jié)論 miR-129可能參與了食管鱗癌進(jìn)展，miR-129表達(dá)的升高可能提示食管鱗癌患者的不良預(yù)后。

食管鱗狀細(xì)胞癌 miR-129 無(wú)病生存期 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

microRNAs（miRNAs）是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的小分子非編碼RNA，其進(jìn)化保守，大小長(zhǎng)約20nt左右。miRNAs通過(guò)序列特異性的方式作用于特定靶基因的3′端非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR），由此調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá),從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。最近的研究表明，大部分的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，起到類似于抑癌基因或癌基因的功能。本研究通過(guò)比較食管鱗癌組織與癌旁組織中miR-129表達(dá)水平的差異，探討其與腫瘤的發(fā)展及患者生存預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2010-01—07在浙江省腫瘤醫(yī)院就診的食管癌患者106例，其中男85例，女21例，年齡40～74歲，平均59.7歲。術(shù)前未經(jīng)任何放化療，排除自身免疫性疾病或嚴(yán)重感染性疾病。食管癌根治術(shù)中標(biāo)本切取后均立即放入液氮中冷凍，即刻移至-80℃冰箱保存。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌。癌旁組織為術(shù)中切取距腫瘤邊緣≥5cm處的肉眼下正常的食管組織。食管癌TNM分期，腫瘤分級(jí)均參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（international union against cancer，UICC）2009年第7版食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ、Ⅱ期64例，Ⅲ期42例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；高、中分化66例，低分化40例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。所有患者均進(jìn)行電話隨訪，隨訪截止時(shí)間為2012年10月1日，其中失訪12例(失訪率11.3%)，失訪患者在生存分析中以最后1次的有效隨訪日期作為的截尾值處理。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 RNA提取試劑盒MirNeasy Mini Kit（Qiagen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司），real time RT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa公司）。real time RT-PCR引物序列如下：下游引物為通用引物,來(lái)自PrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit，hsa-miR-129-5p引物由上海Invitrogen公司合成，信息如下：5′-CUUUUUGCGGUC UGGGCUUGC-3′（Gene ID:406917），內(nèi)參基因U6（U6 small nuclear RNA）序列：5′-CGCAAGGATGACACGCA AATTC-3′（NCBI:X07425.1）。

1.2.2 儀器 real time PCR儀（ABI 7500PCR，Applied Biosystems公司）用于PCR擴(kuò)增，熒光定量和熔解曲線分析。梯度PCR儀（Bio-Rad S1000，Bio-Rad公司）用于逆轉(zhuǎn)錄。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取 總RNA提取參照MirNeasy Mini Kit說(shuō)明書。所有提取的樣本均經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量純度、濃度及瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)完整度，將光密度值A(chǔ)260/A280＞1.8及完整的RNA樣本用于逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 取合格的總RNA（1μg）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。方法和步驟均參照PrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit中說(shuō)明書。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)過(guò)程：激活聚合酶，50℃2min；預(yù)變性，95℃1min；繼續(xù)變性，95℃5s；退火和延伸，60℃34s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線的制作過(guò)程為95℃15s；60℃1min；85℃15s；再60℃15s。每個(gè)樣本重復(fù)3次，將平均Ct值作為結(jié)果。結(jié)果處理按照2-ΔΔCT法：首先計(jì)算出每個(gè)樣本的miR-129及內(nèi)參基因U6的Ct值，ΔCT=Ct（miR-129）-Ct（U6）；再按照ΔΔCT=ΔCT（癌組織）-ΔCT（癌旁組織），算出miR-129在癌組織與癌旁組織之間表達(dá)的差異，即癌組織中miR-129表達(dá)量為正常組織的2-ΔΔCT倍，ΔΔCT＜-1，表示表達(dá)升高2-ΔΔCT倍；ΔΔCT＞1，表示表達(dá)降低2-ΔΔCT倍[1]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以 表示，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，并采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織和癌旁組織中miR-129的表達(dá)水平 106例食管鱗癌標(biāo)本中，有36例（33.9%）出現(xiàn)了不同程度的miR-129表達(dá)上調(diào)，與癌旁組織比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；另有58例(54.7%)表現(xiàn)出miR-129的表達(dá)下調(diào)，12例表達(dá)無(wú)變化。其中，表達(dá)上調(diào)最高達(dá)3297.72倍，下調(diào)最低達(dá)0.10倍。食管鱗癌組織中miR-129的平均表達(dá)量為（129.913±488.331），明顯高于癌旁組織（1.061±0.118），兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見圖1-2。

圖1 患者食管鱗癌組織中miR-129相對(duì)癌旁組織的表達(dá)量

圖2 患者食管鱗癌組織與癌旁組織中miR-129平均表達(dá)量

2.2 miR-129表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 研究miR-129的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系后得出，miR-129相對(duì)表達(dá)量在不同性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、腫瘤分期以及有無(wú)飲酒史的患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。其中，男性或有飲酒史的患者miR-129相對(duì)表達(dá)量顯著高于女性或無(wú)飲酒史的患者；中低分化的腫瘤患者的miR-129相對(duì)表達(dá)量高于高分化患者；Ⅲ期食管鱗癌患者的miR-129相對(duì)表達(dá)量高于Ⅰ、Ⅱ期患者；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的N1～3組患者的miR-129相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的N0組，見表1。

表1 患者miR-129表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 miR-129表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

2.3.1 將106例患者分為miR-129相對(duì)表達(dá)量未升高和升高兩組，利用Kaplan-Meier法比較兩組患者的無(wú)病生存期，提示miR-129相對(duì)表達(dá)量未升高的患者較升高的患者有生存優(yōu)勢(shì)（P＜0.01），見圖3。

2.3.2 臨床病理特征、生活習(xí)慣與生存時(shí)間的相關(guān)分析 利用Cox回歸模型分析臨床病理特征及生活習(xí)慣吸煙、飲酒對(duì)生存時(shí)間的影響，提示miR-129的相對(duì)表達(dá)量、腫瘤的分化程度、性別是影響食管鱗癌患者生存時(shí)間的因素，風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)分別為5.173、0.337、0.280（均P＜0.05），說(shuō)明miR-129相對(duì)表達(dá)量是影響生存的危險(xiǎn)因素，高分化程度和女性是生存的保護(hù)因素，見表2。

圖3 miR-129相對(duì)表達(dá)量不同患者的生存曲線

表2 影響106例食管鱗癌患者無(wú)病生存期的多因素分析

3 討論

食管癌在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中排名第6，病死率排名第4[2]，且一旦發(fā)生即進(jìn)展迅速，僅14%～21%的食管癌局限于黏膜層（T1），30%～68%的食管癌浸潤(rùn)肌層并轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)（T2），50%的食管癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或已經(jīng)無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除[3-4]。因此，研究與食管癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)的分子對(duì)診斷治療有重要意義。

1993年，在研究蠕蟲的基因lin-4時(shí)第1次發(fā)現(xiàn)了miRNA[5]。通過(guò)克隆和生物學(xué)信息技術(shù)，至今已發(fā)現(xiàn)1000多種miRNA，不僅發(fā)現(xiàn)miRNA包含了大約3%的蛋白編碼基因，還發(fā)現(xiàn)其參與許多基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]。近年來(lái)，大量研究也表明，miRNA的異常表達(dá)、調(diào)控可能參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、組織侵襲與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7-10]。如miR-15a和miR-16a表達(dá)的減少可引起靶基因抗凋亡因子（B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2）表達(dá)的增加，引起細(xì)胞抗凋亡的活性增加，促進(jìn)成人B細(xì)胞慢性淋巴瘤的發(fā)生[11-12]。在乳腺癌中，miR-10b起到類癌基因的作用，miR-10b的表達(dá)的增加，減少其靶基因（homeoboxD-10,HOXD10）的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（ras homolog family member C,RHOC）表達(dá)增加，促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性說(shuō)明循環(huán)miRNA可能是一種腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)記物。且有研究表明，miRNA的表達(dá)具有明顯的組織細(xì)胞特異性更進(jìn)一步提示miRNA可作為預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生，判斷腫瘤進(jìn)展、預(yù)后的特異性生物指標(biāo)[14]。

研究表明，miR-296、miR-143、miR-145、miR-21、miR-205與食管癌的發(fā)生有關(guān)[15-16]，miR-31和miR-142-3p的表達(dá)水平與食管鱗癌的分化程度有關(guān)[17]，miR-200c、miR-194和miR-192的表達(dá)可區(qū)分不同病理類型的食管癌[15]，miR-21的過(guò)表達(dá)及miR-375在食管癌組織中的表達(dá)減少與患者的預(yù)后不良有關(guān)[16]，均說(shuō)明microRNA在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中起到了不可忽略的作用。

miR-129與多種惡性腫瘤相關(guān)，在不同的腫瘤中表達(dá)水平各異，所起作用也不同。乳腺癌中miR-129表達(dá)的增加可上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，從而阻礙乳腺癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力，抑制乳腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移[18]。膀胱癌細(xì)胞中miR-129表達(dá)的增加會(huì)降低膀胱癌細(xì)胞的穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展[19]。miR-129還通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SOX4和乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶1，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[19]。

本研究中106例食管鱗癌組織標(biāo)本中36例的miR-129相對(duì)癌旁正常組織的表達(dá)量升高，與葉昱坪[20]等的研究結(jié)果一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)miR-129相對(duì)表達(dá)越高的患者腫瘤分化程度越低，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分期越晚，進(jìn)一步說(shuō)明miR-129的表達(dá)升高與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。miR-129相對(duì)表達(dá)水平、腫瘤分化程度、不同性別是影響食管鱗癌患者生存的因素，說(shuō)明miR-129的表達(dá)與食管鱗癌的預(yù)后相關(guān)。

RNASEN酶參與miRNA從premiRNA剪切形成成熟miRNA的過(guò)程，miR-129表達(dá)與RNASEN酶的表達(dá)呈正相關(guān)，RNASEN酶在食管癌組織中表達(dá)的上升可促進(jìn)食管惡性腫瘤的發(fā)展、侵襲[21]。miR-129還可通過(guò)抑制APC基因和Ras基因的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使APC基因和Ras基因的表達(dá)受限，引起體內(nèi)生物學(xué)過(guò)程紊亂[22]，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。也有研究表明，miR-129的靶基因?yàn)門AMTA1和EIF2CA，兩者都是miRNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，或許miR-129通過(guò)調(diào)控其他腫瘤相關(guān)miRNA的轉(zhuǎn)錄，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[23]。miR-129在不同腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用，說(shuō)明miR-129的作用具有腫瘤特異性。

miRNA是一類新興研究熱點(diǎn)，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用還需進(jìn)一步的研究。本研究提示，miR-129可能是一種促進(jìn)食管鱗癌發(fā)展的分子，其表達(dá)可能影響著食管鱗癌的發(fā)生、進(jìn)展，同時(shí)還與患者的生存預(yù)后有關(guān)。但是，miR-129參與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的具體分子學(xué)機(jī)制還未清楚，需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

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The relationship between miR-129 and prognosis for patients with esophageal squamous cell carcinoma

YANG Shizhou,LING

Zhiqiang,LI Pei,et al.School of the First Clinical Medical Sciences,Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】Objective To investigate the expression of miR-129 and its correlation with the prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC). Methods Total RNA was extracted from tissue specimens of 106 cases of ESCC. Real-time RT-PCR was applied to detect the expression of miR-129 in primary ESCC tissues and normal esophageal tissues. Results High-expression and low-expression of miR-129 was detected in 36(33.9%),and 58(54.7%)ESCC samples,respectively.The expression levels of miR-129 in males,alcohol user were higher than those in females and non drinkers(P＜0.05).The high-expression of miR-129 was significantly correlated with regional lymph node involvement,differentiation and disease stage (P＜0.05).The disease-free survival in patients with high expression of miR-129 was shorter than that in patients with low expression. Conclusion Our findings suggest that miR-129 may be involved in the progression of ESCC and prognosis of patients.

ESCC miR-129 DFS Regional lymph node involvement

2012-10-11）

（本文編輯：胥昀）

衛(wèi)生部科研基金（WKJ2010-2-004）；浙江省自然基金項(xiàng)目（Y2091110）；浙江省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（2011C13039-1）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院（楊詩(shī)舟、毛偉敏、季文豪，楊詩(shī)舟系碩士研究生，現(xiàn)在浙江省腫瘤醫(yī)院實(shí)習(xí)，毛偉敏系溫州醫(yī)學(xué)院碩士生導(dǎo)師）；浙江省腫瘤醫(yī)院、浙江省腫瘤研究所、浙江省胸部腫瘤（肺、食管）診治技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（毛偉敏、凌志強(qiáng)、季文豪）；鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室（李沛、董子明）

毛偉敏，E-mail:maowm@163.com