劉 冰，李冬植，胡長志，查順清

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

植物內(nèi)生菌是指在其生活史中的某一段時期生活在健康植物組織內(nèi)部，不引起植物組織明顯癥狀的一類菌，包括真菌、細(xì)菌、放線菌［1－2］。植物內(nèi)生菌長期生活于植物體內(nèi)，與宿主互相適應(yīng)，形成了一系列有益于宿主植物的生物學(xué)機(jī)能［3］。其中某些內(nèi)生菌可以抵抗病蟲害的作用已經(jīng)成為共識［4］，但植物內(nèi)生菌的存在對其寄主品種抗性是否有影響的直接研究卻比較少。

被稱為“柑橘癌癥”的潰瘍病是柑橘上的一種重要病害，其對柑橘品種的選擇性非常強(qiáng)［5］。目前認(rèn)為，這種選擇性與柑橘表皮組織結(jié)構(gòu)［6］、生理組分及含量［7］、氧化酶類［8］、植保素［9］及抗性基因［10］等關(guān)系密切。柑橘體內(nèi)的內(nèi)生菌是否與寄主品種抗病性之間有一定的關(guān)系呢?本試驗(yàn)以溫州蜜柑(抗?jié)儾∑贩N)和贛南紐荷爾臍橙(感潰瘍病品種)為材料，從中分離純化出內(nèi)生細(xì)菌并測定其抑菌防病活性，初步分析這些菌株與寄主品種抗?jié)儾≈g的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品與菌種

溫州蜜柑的夏梢嫩葉和幼果采于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)園，贛南紐荷爾臍橙的夏梢嫩葉和幼果在贛南臍橙園中多點(diǎn)取樣獲得，柑橘潰瘍病菌由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植病實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 分別稱取溫州蜜柑和贛南紐荷爾臍橙的嫩葉和幼果用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和1 g/L升汞進(jìn)行表面消毒。為判斷表面消毒是否完全，把最后一次漂洗滅菌材料的漂洗液吸取100μL涂布于NA培養(yǎng)基上，每個處理重復(fù)2次，培養(yǎng)48 h后觀察有無菌落產(chǎn)生，若無則表明表面消毒完全。將表面消毒好的材料用無菌剪刀分別剪取適量于研缽中備用，剩余材料再次稱量，計算所用材料重量。

采用稀釋法分離內(nèi)生細(xì)菌。每個研缽中加入5mL無菌水分別研磨至汁液，靜置15min，移取1mL于離心杯中作為原液，進(jìn)而稀釋到10－1、10－2、10－3等不同濃度。共有溫州蜜柑葉、果，贛南臍橙葉、果四組研磨液。每組研磨液每個稀釋度均分別取100μL于NA培養(yǎng)基上涂布均勻，重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿放于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況，及時進(jìn)行菌株純化，記錄各菌落的形態(tài)特征，進(jìn)一步將菌種接種于試管進(jìn)行斜面培養(yǎng)保存［11］。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌對柑橘潰瘍病菌的抑制效果測定 對實(shí)驗(yàn)室保存的柑橘潰瘍病菌活化后進(jìn)行抑菌效果測定，采用抑菌圈法。用移液器吸取100μL潰瘍病菌菌液于培養(yǎng)基上，用涂抹棒涂抹均勻，然后用打孔器(d=0.8 cm)于培養(yǎng)基中打4個對稱的孔，將純化后的內(nèi)生菌接種于孔壁周圍(對照接種無菌水)，于30℃恒溫箱中培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)。以后每隔12 h觀察1次，記錄抑菌圈直徑并拍照［11］。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌對贛南紐荷爾臍橙潰瘍病離體葉片的防治效果測定 采用針刺法接種。取紐荷爾臍橙的新鮮葉片(顏色剛轉(zhuǎn)綠)，分別在葉脈的兩側(cè)用昆蟲針刺孔。每葉刺18個孔，每3個孔為一組，共6組。用滅菌濾紙圓片(直徑5mm)吸足供接種的潰瘍病菌菌懸液，貼在3個針刺點(diǎn)上，每葉6個濾紙片。將待測內(nèi)生細(xì)菌的菌懸液均勻噴于已接種病菌的葉片上，對照噴清水。處理后的葉片放置在倒有水瓊脂的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿內(nèi)放置1葉，在27℃培養(yǎng)，每個處理3片葉片。24 h后除去濾紙片，3 d后開始觀察葉片發(fā)病情況，7 d后進(jìn)行記錄和拍照，統(tǒng)計發(fā)病情況［12－13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

試驗(yàn)分離出的菌株根據(jù)分離植物器官和菌落特征進(jìn)行初步分類。結(jié)果表明，從溫州蜜柑上分離到的內(nèi)生細(xì)菌菌落數(shù)為7.12×104cfu/g鮮組織，菌株共有10種(葉片上6種、果實(shí)上4種)，其中的優(yōu)勢菌株為WZ132和WZ131(圖1，表1);從贛南紐荷爾臍橙上分離到的內(nèi)生細(xì)菌菌落數(shù)為1.27×104cfu/g鮮組織，菌株共有18種(葉片上11種、果實(shí)上7種)，其中菌落數(shù)最多的菌株為GN231，其次為GN211和GN213，另外葉片中分離的菌株GN223、GN213分別與果實(shí)中分離到的菌株GN232、GN242菌落特征相似(圖2，表2)。由此可見，溫州蜜柑中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種類較贛南紐荷爾臍橙中的少、數(shù)量較臍橙中的多。

圖1 溫州蜜柑中主要可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種類及數(shù)量Fig.1 Variety and quantity of the major endophytic bacteriacultured from citrus unshiu Marc

圖2 贛南臍橙(紐荷爾)中主要可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種類及數(shù)量Fig.2 Variety and quantity of the major endophytic bacteria cultured from citrus sinensis Osbeck

圖3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌抑菌效果Fig.3 The antibacterial effect of endophytic bacteria from orange

表2 贛南臍橙內(nèi)生細(xì)菌對潰瘍病菌的抑菌效果Tab.2 The inhibiting effect of endophytic bacteria from Citrus sinensis Osbeck in Jiangxi Gannan to Xanthomonas axonopodis pv.citri

表3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對贛南紐荷爾臍橙潰瘍病的離體防治效果Tab.3 The control effect of antibacterial endophytic bacteria on citrus canker of Navel Orange in Jiangxi Gannan in vitro

2.2 內(nèi)生細(xì)菌對柑橘潰瘍病菌的抑菌效果

經(jīng)計算可得，溫州蜜柑中獲得的有抑菌效果的內(nèi)生細(xì)菌菌落數(shù)為8.47×103cfu/g鮮組織，其對潰瘍病菌的抑菌圈平均直徑為1.93 cm;其中優(yōu)勢菌株WZ131抑菌效果最好，抑菌圈直徑為2.50 cm。其次為菌株WZ 122和WZ114(表1，圖3)。贛南紐荷爾臍橙中有抑菌效果的內(nèi)生細(xì)菌菌落數(shù)為1.23×103cfu/g鮮組織，其對潰瘍病菌的抑菌圈平均直徑為1.42 cm，效果比較好的有菌株 GN241、GN232、GN222和GN214等;其中抑菌最優(yōu)的菌株GN241的抑菌圈直徑可達(dá)2.60 cm，但其數(shù)量僅占菌落總數(shù)的4%，抑菌效果居于其后的GN232和GN222所占菌落總數(shù)的比例也很小(表2，圖2，圖3)。由此可見，溫州蜜柑中拮抗內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量比贛南臍橙中的多，而且整體抑菌能力更強(qiáng)。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌對贛南紐荷爾臍橙潰瘍病離體葉片防治效果

從表3可以看出，分離自溫州蜜柑的拮抗菌株對臍橙潰瘍病的防治效果較差，菌株WZ124防效最好，為57.81%;臍橙葉片接種潰瘍病菌和菌株GN222后發(fā)病很輕，在對照葉片發(fā)病已經(jīng)腐爛后，處理仍然可以保持20多天不腐爛。此外，分離自贛南紐荷爾臍橙的拮抗菌株對臍橙潰瘍病的整體防治效果較好，這可能是因?yàn)檫@些菌株分離自臍橙組織，因此可以更好地定殖在接種葉片體內(nèi)。

3 討論

目前，國內(nèi)外對植物內(nèi)生菌與寄主抗病性之間關(guān)系的研究較少，已有研究也主要是集中在內(nèi)生菌種群數(shù)量與寄主品種抗病性的關(guān)系上，如在馬鈴薯與軟腐?。?4］、煙草與青枯病［15］、玉米與紋枯病［16］、桉樹與青枯?。?7］等關(guān)系中的內(nèi)生菌研究。盡管如此，這些研究結(jié)果還是指出了植物內(nèi)生菌與其寄主品種抗病之間可能存在著廣泛的協(xié)同作用。筆者研究發(fā)現(xiàn)，柑橘潰瘍病抗病品種中的細(xì)菌拮抗能力要遠(yuǎn)強(qiáng)于感病品種的;雖然感病品種中也有很多拮抗細(xì)菌，但是其數(shù)量太少且拮抗能力弱，不能影響到寄主品種的感病性。這初步闡明了柑橘內(nèi)生細(xì)菌的特性與寄主品種抗?jié)儾≈g的協(xié)同關(guān)系。

長期以來，防治柑橘潰瘍病主要依靠加強(qiáng)栽培管理、頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥等措施，盡管取得一定效果，但費(fèi)時費(fèi)力、易產(chǎn)生抗藥性且不符合人們對綠色食品需求的趨勢［18－19］。因此，尋求安全有效的防治方法對柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展意義深遠(yuǎn)。生物防治是一種對環(huán)境友好的防治措施，目前在生產(chǎn)中已經(jīng)有比較廣泛的應(yīng)用，但是在柑橘潰瘍病的防治方面卻仍處于摸索階段。本研究從贛南紐荷爾臍橙中分離到的幾株內(nèi)生細(xì)菌對潰瘍病的防治效果良好，尤其是菌株GN222的防效達(dá)到89.4%，可作為贛南臍橙潰瘍病的一種優(yōu)良生物防治資源。

接種試驗(yàn)表明，從贛南紐荷爾臍橙中分離到的內(nèi)生拮抗細(xì)菌雖然拮抗能力不強(qiáng)，但是其對紐荷爾臍橙潰瘍病的防效卻較好，這可能是因?yàn)檫@些菌株來自于臍橙體內(nèi)，能更好地適應(yīng)寄主體內(nèi)的環(huán)境，這也進(jìn)一步表現(xiàn)了這些內(nèi)生細(xì)菌作為臍橙潰瘍病生物防治資源的優(yōu)勢。

本試驗(yàn)中，用于分離內(nèi)生細(xì)菌的材料——感潰瘍病品種溫州蜜柑和抗病品種贛南紐荷爾臍橙的組織采自于不同地區(qū)，這可能對內(nèi)生細(xì)菌種群會有一些影響，因此推測試驗(yàn)結(jié)論的精確性或有微小的誤差，在今后的工作中對這個問題需要進(jìn)行闡釋。此外，本試驗(yàn)還只是初步探索，對于柑橘內(nèi)生細(xì)菌與寄主品種抗病性之間的協(xié)同關(guān)系還需要更有力的證據(jù)和更深入的研究，比如柑橘體內(nèi)難培養(yǎng)細(xì)菌的種類、數(shù)量和特性以及協(xié)同機(jī)理等，筆者將繼續(xù)開展這方面的工作。

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