邢朝斌，孟春燕，修樂山，勞鳳云，莊鵬宇

（河北聯(lián)合大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.公共衛(wèi)生學(xué)院；c.藥學(xué)院，河北 唐山 063000）

刺五加Eleutherococcus senticosus具有多種生理活性和藥理作用，是我國醫(yī)藥珍品[1-3]。刺五加具有長、中、短3種不同長度花絲的類型，長花絲類型是雄性，短花絲類型是雌性，中花絲類型是兩性的，屬非常少見的單全異株性別系統(tǒng)[4]。不同性別的刺五加在形態(tài)結(jié)構(gòu)[4-5]、遺傳[5]和藥用成分含量[6]上均存在一定的差異。其中催化藥用成分生物合成的相關(guān)酶基因表達(dá)量的差異是形成不同性別藥用植物中藥用成分含量差異的關(guān)鍵[2,7]。

皂苷類化合物是刺五加的主要活性成分之一[1-2]。刺五加的皂苷類化合物的生物合成過程中，催化3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A生成甲羥戊酸的3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR）[8]、催化甲羥戊酸焦磷酸與ATP進(jìn)行反應(yīng)生成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（mevalonate diphosphate decarboxylase，MDD）[9]、催化 2個(gè) IPP分子和1個(gè)二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate）分子生成法尼基二磷酸（farnesyl diphosphate）的法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）[10]，三者為重要的限速酶。本文中通過實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）法檢測了不同性別類型刺五加中HMGR、MDD和FPS的表達(dá)情況，并分析了其與皂苷含量的相關(guān)性，旨在為闡明不同性別刺五加中皂苷含量差異的機(jī)理提供資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為采自吉林省梅河口市的3年生不同性別的野生刺五加。經(jīng)鑒定為五加科植物刺五加E.senticosus。以生產(chǎn)中傳統(tǒng)采用的采收時(shí)間[6]（7月26日）的葉片為提取RNA和測定皂苷含量的試材。

1.2 試 劑

刺五加總皂苷含量測定中所用齊墩果酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號(hào)：110709-200505）；石油醚、濃硫酸、甲醇、香蘭素、乙醇均為國產(chǎn)分析純；市售娃哈哈純凈水；植物總RNA提取試劑盒、RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTM II購 自 寶生物工程（大連）有限公司；X-gal、IPTG、Taq DNA聚合酶、Puf DNA聚合酶、dNTPs、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。PGM-T克隆試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和TOP-10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PAGE純化。

1.3 刺五加cDNA的獲得與引物驗(yàn)證

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒和RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit的說明，分別提取3種性別類型刺五加5株樣本的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)已克隆的刺五加HMGR（HQ456918）[8]、MDD（HQ456918）[9]、FPS（HQ456918）[10]和GAPDH（HQ184063）[11]基因的cDNA 序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)real time PCR擴(kuò)增的特異性引物。HMGR的上游引物為5'-GGATTGAAGGGCGAGGAAA-3'，下游引物為5'-GCAACAGCAGAACCAGCAAG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為136 bp；MDD的上游引物為5'-GATTGTGGGTATTGGGTTGGA-3'，下游引物為5'-AATGTTGGTTGGCGTTTGAG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為82 bp；FPS的上游引物為5'-TCTCTCCCTCTTTCCCTCCTCT-3'，下游引物 為5'-ATCGCTCATTCTGGCTGGTT-3'， 預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為132 bp；GAPDH的上游引物為5'-GATTTGGCATTGTTGAGGG-3'，下游引物為5'-TGCTATCGCCTATGAAGTCC-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為134 bp。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用Puf DNA聚合酶和上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PGM-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后，送Invitrogen公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期相符則為特異性強(qiáng)。

1.4 Real time PCR反應(yīng)與數(shù)據(jù)的收集與分析

以逆轉(zhuǎn)錄獲得的刺五加cDNA為模板，利用1.3中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，獲得含高濃度目的基因的DNA溶液，以此溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍梯度稀釋，共5個(gè)梯度，用于制作各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照SYBR?Premix Ex TaqTM II說明的要求，應(yīng)用ABI 7900 HT Real-time PCR system，利用384孔板進(jìn)行real-time PCR分析。Real time PCR反應(yīng)總體系10 μL，其中，不同性別類型刺五加的cDNA或回收獲得的包含各目的基因的高濃度DNA模板1 μL，上、下游引物各0.3 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM II 5 μL， ROX reverse（50×） 0.2 μL，ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。之后進(jìn)行溶解曲線分析，鑒定產(chǎn)物的特異性。溶解曲線分析溫度為60～95 ℃，每1 ℃讀1次，持續(xù)5 s，重復(fù)3次。

運(yùn)用ABI 7900 HT Real-time PCR system自帶的SDS 2.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，參照文獻(xiàn)[12]和[13]中的方法，分別計(jì)算不同性別類型刺五加樣本中HMGR、MDD和FPS基因的表達(dá)量。

1.5 刺五加總皂苷含量的測定與相關(guān)性分析

參照文獻(xiàn)[12]中的方法分別測定不同性別類型刺五加樣本在543 nm處吸光度，利用回歸方程Y＝118.35X＋4.037 6，r＝0.999 7（n＝ 5），計(jì)算其總皂苷的含量。根據(jù)總皂苷的含量，應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析不同性別類型刺五加的總皂苷含量和HMGR、MDD和FPS基因表達(dá)量間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性的驗(yàn)證

刺五加HMGR、MDD和FPS和GAPDH基因real-time PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為單一條帶，無引物二聚體，片段大小與預(yù)期相符（見圖1）。各基因的溶解曲線僅具有單一的特異峰，也表明無引物二聚及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖2），擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果表明，各基因的擴(kuò)增結(jié)果與目的基因的對應(yīng)片段完全相符，說明依據(jù)各基因cDNA序列設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性，建立了其較好的real-time PCR反應(yīng)條件。

圖1 刺五加HMGR、MDD、FPS和GAPDH基因realtime PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Real-time PCR products of HMGR, MDD, FPS and GAPDH in E. senticosus

圖2 刺五加HMGR、MDD、FPS和GAPDH基因溶解曲線Fig.2 Dissociation curve of HMGR, MDD,FPS and GAPDH in E. senticosus

2.2 不同性別刺五加HMGR、MDD和FPS基因的表達(dá)分析

HMGR、MDD和FPS基因在長、中和短3種花絲類型刺五加中的表達(dá)量變化如圖3所示。各基因在3種花絲類型刺五加中均有表達(dá)，且表達(dá)規(guī)律相似，HMGR、MDD和FPS基因的最高表達(dá)量均出現(xiàn)在短花絲類型刺五加中，中花絲類型的表達(dá)量次之，最低表達(dá)量均出現(xiàn)在長花絲類型刺五加中。所不同的是FPS基因在中花絲和短花絲類型刺五加中的表達(dá)量差異未達(dá)顯著水平。HMGR、MDD和FPS的最高表達(dá)量分別為最低表達(dá)量的1.87、2.02和1.58倍。

2.3 不同性別刺五加的總皂苷含量

長、中和短3種花絲類型刺五加中均檢測到了總皂苷的存在，但三者的含量差異顯著（P＜0.05），如圖4所示。短花絲類型刺五加的總皂苷含量最大，為最小值（長花絲類型刺五加）的5.52倍，中花絲類型刺五加的總皂苷含量介于兩者之間，為長花絲類型刺五加含量的2.75倍。

圖3 不同性別刺五加HMGR、MDD和FPS基因的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of HMGR, MDD and FPS in different gender types of E. senticosus

2.4 HMGR、MDD、FPS基因的表達(dá)和刺五加總皂苷含量的相關(guān)性

HMGR、MDD、FPS基因的表達(dá)與刺五加中總皂苷含量的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明，HMGR、MDD和FPS基因的表達(dá)量與皂苷含量同升同降，具有顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。HMGR、MDD和FPS基因的表達(dá)量間也存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

三萜皂苷類化合物為刺五加的次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物是植物長期進(jìn)化中適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物，抵抗環(huán)境脅迫是其重要的生態(tài)學(xué)功能之一[14]。對于雌雄異株植物而言，其不同性別類型個(gè)體對環(huán)境脅迫的適應(yīng)也是不同的，雌性個(gè)體通常對環(huán)境脅迫的耐受能力低于雄性個(gè)體[15]，從而形成積累較多的次生代謝產(chǎn)物以提高其抵抗外界壞境脅迫水平的現(xiàn)象。如穿龍薯蕷雌株中的薯蕷皂苷含量顯著高于雄株中的含量。已有的研究[4]和本試驗(yàn)中的結(jié)果均表明，刺五加雌株的皂苷含量顯著高于雄株中的含量，這與上述觀點(diǎn)是完全相符的。

表1 HMGR、MDD、FPS基因的表達(dá)和刺五加總皂苷含量的相關(guān)性Table 1 Correlation of HMGR, MDD and FPS genes expression and saponins content in E. senticosus

藥用植物次生代謝產(chǎn)物的含量由催化其生物合成的酶基因的表達(dá)量決定[16]。HMGR、MDD和FPS基因是催化皂苷類化合物生物合成限速酶基因，HMGR基因的超表達(dá)可使黃花蒿中的萜類化合物含量提高22.5%[17]，MDD基因的表達(dá)高峰[9]與刺五加皂苷合成的高峰[6]基本吻合，人參FPS基因的高表達(dá)可提高人參皂苷的含量。本研究中，刺五加的HMGR、MDD和FPS基因的最高表達(dá)量和皂苷含量的最大值均出現(xiàn)在短花絲類型刺五加中，中花絲類型的次之，長花絲類型的最低。不同性別類型刺五加中HMGR、MDD和FPS基因的表達(dá)與皂苷含量間同升同降，HMGR、MDD和FPS的表達(dá)量和皂苷含量間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，說明HMGR、MDD和FPS基因是形成不同性別刺五加中皂苷含量差別的關(guān)鍵酶基因。

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