武應(yīng)霞，畢會(huì)濤，李繼東，胡春瑞，馮建燦

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

喜樹(shù)Camptotheca accuminata是我國(guó)原產(chǎn)樹(shù)種，因能生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的喜樹(shù)堿而受到關(guān)注。喜樹(shù)堿是次生代謝的產(chǎn)物，已完成的研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下喜樹(shù)堿在喜樹(shù)中的含量很低，在水分脅迫條件下喜樹(shù)幼苗葉片的喜樹(shù)堿含量明顯升高[1]，同時(shí)其它環(huán)境因子對(duì)喜樹(shù)幼苗中喜樹(shù)堿含量的影響也得到了關(guān)注，如水漬和遮蔭[2]、光強(qiáng)[3]、增施氮磷鉀復(fù)合肥[4-5]。激素類物質(zhì)在調(diào)節(jié)植物初生長(zhǎng)和發(fā)育的同時(shí)，對(duì)植物的次生代謝也有著重要的影響。如在黑莨菪轉(zhuǎn)化根培養(yǎng)中NAA對(duì)根的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，但是與沒(méi)有添加生長(zhǎng)素的對(duì)照相比，生物堿的積累提高了1倍，即外源生長(zhǎng)素不影響生長(zhǎng)，但是可以增加生物堿的含量[6]。相反，在長(zhǎng)春花的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，去除2,4-D則可以增加喜樹(shù)堿的含量[7]。BA和水楊酸可以增加水培條件下喜樹(shù)中喜樹(shù)堿的含量，但由于生物量的降低，并沒(méi)有提高喜樹(shù)堿的總產(chǎn)量；NAA對(duì)喜樹(shù)堿的含量沒(méi)有影響，但是能降低喜樹(shù)堿的產(chǎn)量[8-9]。而茉莉酸甲酯和乙烯利也能在一定程度上增強(qiáng)喜樹(shù)堿的合成，而且因?yàn)檎T導(dǎo)子含量不同而表現(xiàn)出一定的差異[10]。然而關(guān)于ABA對(duì)喜樹(shù)堿積累的影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

在對(duì)喜樹(shù)在水分脅迫下內(nèi)源ABA含量和喜樹(shù)堿含量的變化的研究中[11]，發(fā)現(xiàn)在脅迫下二者均隨著脅迫強(qiáng)度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。然而，在水分脅迫下喜樹(shù)中ABA與喜樹(shù)堿含量變化之間是否存在某種關(guān)聯(lián)尚未可知。如果二者存在一定的聯(lián)系，那么就可以利用ABA來(lái)誘導(dǎo)和促進(jìn)喜樹(shù)堿的合成，從而得到滿足需要的喜樹(shù)堿提取材料。

因此，本試驗(yàn)中利用高分子滲透調(diào)節(jié)劑聚乙二醇（polyethylene，PEG）模擬干旱脅迫處理喜樹(shù)幼苗，使用ABA和ABA合成抑制劑氟啶酮（Fluridone）預(yù)處理喜樹(shù)幼苗，研究在此條件下喜樹(shù)幼苗內(nèi)ABA含量、喜樹(shù)堿含量及抗氧化酶活性的變化，以探討ABA在喜樹(shù)堿生物合成中所起的作用，以及ABA對(duì)抗氧化酶的誘導(dǎo)作用，旨在為喜樹(shù)堿的化學(xué)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)采用4周齡喜樹(shù)實(shí)生幼苗為試驗(yàn)材料。

喜樹(shù)種子采于河南省桐柏縣。挑選飽滿種子，用0.1%HgCl2消毒20 min，冷水浸種24 h，后與濕沙1∶1混合催芽，15 d后將種子與沙分離，把種子放在1個(gè)帶蓋容器內(nèi)再催芽。再過(guò)10 d，選取健壯幼苗定植到16 cm×22 cm塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)，用泡沫板和脫脂棉固定，加入100 mL 1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每2 d換1次營(yíng)養(yǎng)液。放入LRH-250-GSⅡ微電腦控制人工氣候箱中培養(yǎng)，光照時(shí)間為8:00～22:00，濕度70%，溫度25 ℃，每天早晚各通氣10 min。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)中共設(shè)置4個(gè)處理：

（1）1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)（CK）；

（2）1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中加入15% PEG 6000 處理（PEG）；

（3）1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中加入15%PEG 6000處理＋10 μmol·L-1ABA處理（PEG＋ABA）；

（4）10 mmol·L-1氟啶酮營(yíng)養(yǎng)液預(yù)處理24 h后再以15%PEG6000處理（PEG＋氟啶酮）。

每個(gè)處理重復(fù)3次。在處理開(kāi)始0、12、24、36、48、60 h時(shí)分別取幼苗全株，分別用于超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的分析。在60 h時(shí)取幼苗全株5 g左右用于喜樹(shù)堿（CPT）含量測(cè)定。在處理開(kāi)始0、24、36、60 h時(shí)取幼苗全株1 g左右用于脫落酸（ABA）含量測(cè)定。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定采用 NBT光照化學(xué)還原法[12]；過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定采用愈傷木酚氧化法[13]；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[13]；喜樹(shù)堿含量的測(cè)定采用高效液相色譜法（HPLC法）；脫落酸（ABA）含量的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)喜樹(shù)幼苗過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響

POD 在植物體內(nèi)具有廣泛的作用，其主要作用之一是催化H2O2降解。各處理中喜樹(shù)幼苗內(nèi)POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）。在PEG處理中，POD活性在12 h時(shí)達(dá)到最大值106.8 U·g-1min-1，較同期對(duì)照值高61.08%，在60 h時(shí)下降到77.5 U·g-1min-1，較對(duì)照高21.85%。在PEG+ABA處理中，POD活性在12 h時(shí)達(dá)到最大值117.7 U·g-1min-1，較對(duì)照高77.53%，較PEG處理下最大值高10.21%，在60 h時(shí)下降到90.0 U·g-1min-1，較對(duì)照高41.51%。在PEG+氟啶酮處理中，POD活性在24 h時(shí)達(dá)到最大值87.3 U·g-1min-1，較對(duì)照高37.48%，較PEG處理下最大值低22.34%，到60 h時(shí)下降到72.4 U·g-1min-1，較對(duì)照高13.84%。外源ABA可以提高POD活性[14]，而ABA抑制劑使POD活性降低。

圖1 滲透脅迫對(duì)喜樹(shù)幼苗過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響Fig.1 Effect of osmotic stress on POD activity in Camptotheca acuminata seedlings

2.2 對(duì)喜樹(shù)幼苗超氧化物歧化酶活性（SOD）的影響

SOD的主要功能是清除氧自由基，是防止其對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)傷害的一種很重要的抗氧化酶。各處理導(dǎo)致喜樹(shù)幼苗內(nèi)SOD活性下降（見(jiàn)圖2）。在PEG處理中，SOD活性在12 h時(shí)已經(jīng)下降到32.7 U·mg-1，比對(duì)照低35.78%，隨后下降速度減緩，至60 h時(shí)SOD活性小幅上升，為29.8 U·mg-1，仍比對(duì)照低52.01%。在PEG＋ABA處理中，SOD活性呈下降趨勢(shì)，但下降幅度比PEG處理小，60 h時(shí)，SOD活性值為31.7 U·mg-1，較對(duì)照低42.90%，較PEG處理值高6.38%。在PEG＋氟啶酮處理中，SOD活性緩慢下降，12 h時(shí)比對(duì)照低14.41%，較PEG處理高16.21%，60 h時(shí)SOD活性略有上升。在滲透脅迫下，喜樹(shù)幼苗SOD活性不斷下降，在ABA被抑制后，喜樹(shù)幼苗內(nèi)SOD活性高于單純滲透脅迫下的水平，這說(shuō)明ABA抑制劑的使用降低了SOD活性[15]，說(shuō)明ABA與植物抗氧化酶活性有直接關(guān)系。

圖2 滲透脅迫對(duì)喜樹(shù)幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響Fig.2 Effect of osmotic stress on SOD activity in Camptotheca acuminata seedlings

2.3 對(duì)喜樹(shù)幼苗內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響

CAT可把H2O2分解為H2O和O2，以清除H2O2的毒害作用。現(xiàn)在普遍認(rèn)為植物受到環(huán)境脅迫后，保護(hù)酶活性下降。

圖3 滲透脅迫對(duì)喜樹(shù)幼苗內(nèi)過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響Fig.3 Effect of osmotic stress on CAT activity in Camptotheca acuminata seedlings

各處理中喜樹(shù)幼苗內(nèi)CAT活性均降低（見(jiàn)圖3）。在PEG處理中，60 h時(shí)CAT降到最小值2.512 mg·g-1min-1，比對(duì)照低38.41%；在PEG＋ABA處理中，CAT活性在60 h時(shí)達(dá)到最小值2.645 mg·g-1min-1，較對(duì)照低31.46%，較PEG處理下最小值高5.29%；在PEG+氟啶酮處理中，CAT最小值2.953 mg·g-1min-1，比對(duì)照低17.74%，比PEG高17.56%。CAT活性在滲透脅迫下一直下降，ABA抑制劑可以抑制CAT活性下降。

2.4 對(duì)喜樹(shù)幼苗內(nèi)脫落酸（ABA）含量的影響

逆境條件可刺激ABA合成，尤其是干旱脅迫時(shí)更為顯著[16]。滲透脅迫下各處理ABA含量均高于對(duì)照（見(jiàn)圖4）。PEG處理使喜樹(shù)幼苗內(nèi)ABA含量大幅度上升，在12 h時(shí)，達(dá)到最大值1 832 ng·g-1，比對(duì)照高144.84%；在PEG＋ABA處理中，ABA的含量在12 h已經(jīng)上升到1 940 ng·g-1，在36 h時(shí)達(dá)到最大值2 319 ng·g-1，是對(duì)照的233.67%，比PEG處理同期高75.42%。在PEG+氟啶酮處理中，ABA的含量在12 h最高，比對(duì)照最大值高52.45%，較PEG處理的最大值低63.28%，較PEG+ABA處理最大值低106.68%。

2.5 對(duì)喜樹(shù)幼苗內(nèi)喜樹(shù)堿（CPT）含量的影響

各處理的喜樹(shù)堿含量變化不同（見(jiàn)圖5）。PEG處理的喜樹(shù)幼苗內(nèi)喜樹(shù)堿含量為0.120 9%，比對(duì)照高6.61%；在PEG＋ABA處理中，喜樹(shù)堿含量為0.114 4 %，略高于對(duì)照，但低于PEG處理；在PEG＋氟啶酮處理中，低于其它各處理，ABA抑制劑降低了喜樹(shù)堿的含量，這說(shuō)明ABA對(duì)喜樹(shù)堿的合成存在一定的誘導(dǎo)作用。

圖4 滲透脅迫對(duì)喜樹(shù)幼苗內(nèi)脫落酸含量的影響Fig.4 Effect of osmotic stress on ABA content in Camptotheca acuminata seedlings

圖5 滲透脅迫對(duì)喜樹(shù)幼苗內(nèi)喜樹(shù)堿含量的影響Fig.5 Effect of osmotic stress on CPT content in Camptotheca acuminata seedlings

3 結(jié)論與討論

滲透脅迫下喜樹(shù)幼苗的各項(xiàng)抗氧化酶變化趨勢(shì)與其它植物相似[17-19]，滲透脅迫提高了保護(hù)性酶SOD、POD和CAT的活性，提高其抗旱性。

外源ABA及其合成抑制劑對(duì)滲透脅迫下喜樹(shù)幼苗的各項(xiàng)指標(biāo)有較大的影響。滲透脅迫下施用外源ABA致使喜樹(shù)幼苗內(nèi)ABA含量劇烈上升，減少了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，減弱了滲透脅迫導(dǎo)致的抗氧化酶類活性的變化，減輕了滲透脅迫的作用效果。使用抑制劑氟啶酮抑制滲透脅迫下喜樹(shù)幼苗內(nèi)ABA生物合成后，可以降低抗氧化酶類活性的劇烈變化、減少內(nèi)源ABA的積累、減少喜樹(shù)堿因?yàn)闈B透脅迫引起的積累。因此，ABA可以調(diào)控喜樹(shù)幼苗內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和抗氧化酶類活性變化，可以誘導(dǎo)喜樹(shù)堿的生物合成。但是，ABA對(duì)喜樹(shù)堿的生物合成具有促進(jìn)作用的含量閾值范圍以及ABA對(duì)喜樹(shù)堿生物合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的影響還需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]馮建燦,張玉潔,張秋娟. 干旱脅迫與抗蒸騰劑對(duì)喜樹(shù)幾項(xiàng)生理指標(biāo)及喜樹(shù)堿含量的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,36(2): 138－142.

[2]Liu ZJ, Carpenter SB. Camptothecin production inCamptothecaacuminataseedlings in response to shading and ooding[J]. Can J Bot, 1997,75(2):368－373.

[3]王 洋,戴紹軍,閻秀峰. 光強(qiáng)對(duì)喜樹(shù)幼苗葉片次生代謝產(chǎn)物喜樹(shù)堿的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2004,24(6):1118－1122.

[4]Liu ZJ, Adams JC, Viator HP. Influence of soil fertilization,plant spacing, and coppicing on growth, stomatal conductance,abscisic acid, and camptothecin levels inCamptotheca acuminataseedlings[J]. Physiologia Plantarum, 1999,105:402－408.

[5]Li ZH, Liu ZJ. Camptothecin production inCamptotheca acuminatahydroponic culture and nitrogen enrichments[J].Canada J Plant Sci,2005,85:447－452.

[6]Vanhala L, Eava M, Lapinjoki S,et al. Effects of growth regulators on transformed root cultures ofHyoscyamus muticus[J]. J Plant Physiol,1998,153:475－481.

[7]Arvy MP, Imbault N, Naudascher F,et al.2,4-D and alkaloid accumulation in perivinkle cell suspensions[J]. Biochimie-Paris,1994, 76:410－416.

[8]Li ZH, Liu ZJ. Effects of Benzyladenine and Naphthalene acetic acid on growth and camptothecin accumulation inCamptotheca acuminataseedlings[J]. J Plant Growth Regul, 2003,22:205－216.

[9]Li ZH, Liu ZJ. Camptothecin production inCamptotheca acuminataseedlings in response to Acetylsalicylic Acid treatment[J]. Canada J Plant Sci, 2004,84:885－889.

[10]牧 文,劉文哲. 傷害及誘導(dǎo)子對(duì)喜樹(shù)幼苗中喜樹(shù)堿含量的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2007,27(5):0977－0982.

[11]武應(yīng)霞,李繼東,畢會(huì)濤,等. 外源ABA對(duì)滲透脅迫下喜樹(shù)幼苗生理生化指標(biāo)的影響[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2011,28(2):35－41.

[12]Dhindsa R S, Plumb 2 Dhindsa P, Thorpe T A. Leaf senescence:Correlated with increased leaves of membrane permeability and lipid peroxidation and decreased levels of superoxide dismutase and catalase[J]. Exp Bot, 1981,32:93－101.

[13]李合生,孫 群,趙世杰,等. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京:高等教育出版社, 2001.

[14]邢更生,周功克,李志孝. 水分脅迫下山黧豆中ABA 及ODAP 的積累研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2000,11(5):693－698.

[15]周碧燕,郭振飛. ABA及其合成抑制劑對(duì)柱花草抗冷性及抗氧化酶活性的影響[J].草業(yè)科學(xué),2005,14(6):94－99.

[16]Giraudat J, Parcy F, Bertauche N,et al. Current advances in abscisic acid action and signalling[J]. Plant Mol Biol, 1994,26(5): 1557－1577.

[17]吳麗君,李志輝,鄒 峰.水分脅迫對(duì)珍貴樹(shù)種赤皮青岡幼苗生理特性的影響[J].南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(7):10－13.

[18]夏清柱,萬(wàn) 紅,劉惠民,等.人工低溫脅迫下腰果葉片生理生化指標(biāo)的變化[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2012, 30(2):28－32.

[19]梁文斌,蔣麗娟,馬 倩,等.干旱脅迫下光皮樹(shù)不同無(wú)性系苗木的生理生化變化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(4):13－19.