曹小龍，田 云，盧向陽(yáng)

（1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410028；2．湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長(zhǎng)沙410028）

面對(duì)能源日益枯竭、環(huán)境不斷惡化、溫室效應(yīng)日趨嚴(yán)重等問題，綠色可持續(xù)發(fā)展的生物能源受到了廣泛重視，其中燃料乙醇被公認(rèn)為是最有發(fā)展前景的可再生清潔能源之一。木質(zhì)纖維素是燃料乙醇生產(chǎn)中最具潛力的原材料，其轉(zhuǎn)化生成生物燃料的過程主要分為3步：預(yù)處理、糖化和發(fā)酵，其中最重要也最困難的是糖化過程，即將致密的生物質(zhì)原材料分解為可發(fā)酵的還原性單糖。預(yù)處理方法主要有酸水解、堿水解、蒸汽爆破法、超聲波破碎法、氨纖維爆破法等。

預(yù)處理雖然可以很好地降低纖維素聚合度，但會(huì)產(chǎn)生很多對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，主要有以下3類：（1）弱酸，包括乙酸、甲酸、乙酰丙酸等；（2）呋喃醛類，主要是糠醛和羥甲基糠醛；（3）酚類化合物［1］。除了預(yù)處理過程產(chǎn)生的有毒物質(zhì)外，發(fā)酵產(chǎn)物的積累也會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生一定的毒害作用，最終降低生物燃料的產(chǎn)量。有機(jī)溶劑毒性主要體現(xiàn)在：提高了細(xì)胞膜的滲透性和流動(dòng)性，降低了能量轉(zhuǎn)移勢(shì)，破壞了膜蛋白的功能等等［2］。當(dāng)細(xì)胞膜的滲透性提高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)pH值控制受到影響，胞內(nèi)大分子（如RNA、磷脂和蛋白質(zhì)）向外滲透，嚴(yán)重威脅細(xì)胞的生長(zhǎng)及存活；細(xì)胞膜流動(dòng)性的提高會(huì)改變其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，能量勢(shì)的降低則直接影響到各項(xiàng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有機(jī)溶劑的毒性大小與其極性密切相關(guān)，logP值在1～4之間的有機(jī)溶劑易溶于水，易進(jìn)入細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞危害極大［3］。

當(dāng)外界環(huán)境中存在有機(jī)溶劑時(shí)，非耐受菌細(xì)胞膜會(huì)遭到破壞，生理功能受到影響，甚至死亡，耐受菌則會(huì)作出相應(yīng)的改變來(lái)適應(yīng)這種環(huán)境［2］。微生物耐受性的研究，對(duì)生物燃料生產(chǎn)、生物醫(yī)藥開發(fā)、環(huán)境污染治理等都有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。作者在此重點(diǎn)介紹微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受機(jī)制，包括細(xì)胞膜的改變與修飾、輸出泵的作用、熱激蛋白、轉(zhuǎn)化和降解等等。

1 細(xì)胞膜的改變與修飾

細(xì)胞膜作為屏障在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、保持細(xì)菌的正常代謝、在細(xì)胞與環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、能量交換和信息傳遞的過程中起著決定性的作用。研究表明，在微生物耐受性方面，細(xì)胞膜發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要機(jī)制有：脂肪酸飽和度的增加、脂肪酸極性頭部基團(tuán)的改變、不飽和脂肪酸的順反異構(gòu)變化、長(zhǎng)鏈脂肪酸含量增加、新合成一些正常條件下不能合成的脂肪酸等。

1．1 脂肪酸飽和度的變化

飽和脂肪酸相對(duì)于不飽和脂肪酸有更高的相轉(zhuǎn)變溫度，因此，細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量以及酯?；脑黾?，可以提高膜的穩(wěn)定性［4］。侯雪丹等［5］從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）出發(fā)，篩選獲得乙醇耐受菌株 Y－c－8和丙酮耐受菌株 B－g－5，分析發(fā)現(xiàn) Y－c－8中油酸和亞油酸含量從出發(fā)菌的19．24%和0%提高到了26．69%和48．90%，B－g－5中油酸和亞油酸含量分別高達(dá)21．87%和52．57%。楊潔等［6］用LC－MS方法分析乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母的總磷脂的變化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著酵母細(xì)胞由調(diào)整期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，含有不飽和長(zhǎng)鏈的磷脂分子含量減少，含有飽和短鏈的磷脂分子含量顯著增加。Oh等［7］在Escherichia coli基因中敲除一個(gè)參與飽和脂肪酸降解和不飽和脂肪酸合成的基因fad的抑制基因fadR，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上各種飽和脂肪酸含量都大幅增加，耐受性也相應(yīng)地得到了提高。通常認(rèn)為：飽和脂肪酸的增加可以降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，有利于細(xì)胞膜的穩(wěn)定，對(duì)提高細(xì)胞的耐受能力有很好的作用。但飽和脂肪酸的合成需要從頭開始，并且是一個(gè)耗能的過程［8］，因此，脂肪酸飽和度的改變，被認(rèn)為是一種微生物耐受有機(jī)溶劑的長(zhǎng)期機(jī)制。另外，個(gè)別情況下，脂肪酸飽和度的增加提高了細(xì)胞的耐受性，但其乙醇產(chǎn)量并沒有相應(yīng)提高，說明耐受性和乙醇產(chǎn)量并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系［9］。

1．2 脂肪酸極性頭部基團(tuán)的變化

在革蘭氏陰性菌中，磷脂極性頭部基團(tuán)的種類和與之相連的脂肪酸長(zhǎng)度都會(huì)影響到細(xì)胞膜的流動(dòng)性。脂肪酸的磷脂極性頭部基團(tuán)主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和心磷脂3種，且每一種的相轉(zhuǎn)變溫度不同，其中心磷脂的最高，在細(xì)胞膜中最穩(wěn)定。磷脂極性頭部基團(tuán)的改變?cè)赑．putida中比較普遍。溶劑耐受菌P．putida DOT－T1E經(jīng)過甲苯耐受處理后，心磷脂含量從12%上升到25%，磷脂酰乙醇胺含量從78%下降到63%，磷脂酰絲氨酸含量基本保持不變，同位素示蹤法發(fā)現(xiàn)90%的32P整合到心磷脂中［10］。而且，有機(jī)溶劑的logP值越低，心磷脂的含量越高，磷脂酰乙醇胺的含量越低［11］。由此可以推斷，當(dāng)遭遇高有機(jī)溶劑環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜上磷脂中穩(wěn)定性高的極性基團(tuán)含量增加，穩(wěn)定性低的極性基團(tuán)含量減少，最終提高了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

1．3 不飽和脂肪酸的順反異構(gòu)變化

在細(xì)胞膜中，順式和反式不飽和脂肪酸以一定的比例存在著，而且順式不飽和脂肪酸的含量遠(yuǎn)大于反式脂肪酸。在順式不飽和脂肪酸中，雙鍵兩側(cè)的?；湂A角較大，使膜脂排列相對(duì)疏松；而在反式不飽和脂肪酸中，?；湂A角很小，細(xì)胞膜排列緊密、有序，有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可以很好地阻止溶劑進(jìn)入膜內(nèi)。在有機(jī)溶劑刺激下，通過順反異構(gòu)酶（cti）的催化將不飽和脂肪酸由順式轉(zhuǎn)變?yōu)榉词?，可以降低?xì)胞膜的流動(dòng)性和提高溶劑耐受性［2］。Bernal等通過熒光偏振實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cti基因缺陷突變株的細(xì)胞膜致密性不及野生型，而且該基因是單順反子，在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的表達(dá)水平都比較低［12］。還有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入甲苯后，溶劑耐受菌P．putida DOT－T1E在1min內(nèi)即發(fā)生順反異構(gòu)，與加入甲苯前相比，最終順反脂肪酸比例從7．5下降到了1［10］。

順反異構(gòu)是一個(gè)不需耗能的反應(yīng)，能夠迅速有效地進(jìn)行，因此，其很可能是細(xì)胞耐受機(jī)制中最先起反應(yīng)的過程。有人發(fā)現(xiàn)順反異構(gòu)現(xiàn)象在其它環(huán)境（如重金屬、高溫、低pH值等）下也普遍出現(xiàn)，說明這種機(jī)制可能是細(xì)胞應(yīng)對(duì)脅迫的一般防御機(jī)制［11］。

2 輸出泵的作用

細(xì)胞膜作為細(xì)胞的第一道防御屏障，并不能阻擋所有的有機(jī)溶劑，當(dāng)溶劑進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的破壞作用，面對(duì)這種情況，耐受性微生物會(huì)通過與能量偶聯(lián)的輸出泵機(jī)制將胞內(nèi)的溶劑排出，保證其正常的生理環(huán)境，該現(xiàn)象普遍出現(xiàn)在革蘭氏陰性菌中。

輸出泵是能利用質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)將胞內(nèi)溶劑排出的膜蛋白，由3個(gè)功能不同的部分組成，內(nèi)膜蛋白負(fù)責(zé)底物識(shí)別和質(zhì)子逆轉(zhuǎn)運(yùn)，胞質(zhì)連接作為內(nèi)膜泵之間的橋梁，外膜蛋白作為輸出通道，三者缺一不可［2］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量功能各異的輸出泵，這些輸出泵能將包括丁醇、甲苯、苯乙烯、己烷、庚烷、辛烷、抗生素和其它烴類在內(nèi)的多種物質(zhì)排出胞外，并提高細(xì)菌的耐受性。當(dāng)前研究得最透徹的是RND家族（Resistance－nodulation－division family）的輸出泵，例如，P．putida DOTT1E的3個(gè)輸出泵（TtgABC、TtgDEF和TtgGHI）能有效地從細(xì)胞膜上泵出甲苯、苯乙烯、乙基苯和丙基苯4種溶劑［13］；來(lái)自大腸桿菌的輸出泵acrAB－tolC能夠?qū)⒓和?、庚烷、辛烷和壬烷等排出胞外?4］；任靜朝等［15］在志賀菌中也發(fā)現(xiàn)了輸出泵acrAB－tolC，并證實(shí)了該輸出泵能很好地將某些有機(jī)溶劑和抗生素排出胞外。

利用基因手段構(gòu)建工程菌，對(duì)于提高細(xì)菌的耐受性和燃料產(chǎn)量是非常有前景的。Dunlop等［16］利用生物信息學(xué)方法，在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)掘到了43個(gè)輸出泵基因，并將其在大腸桿菌中表達(dá)，用7種常見的有機(jī)溶劑分別測(cè)試其耐受性，發(fā)現(xiàn)43株工程菌對(duì)丁醇和異戊醇的耐受性都沒改變，而對(duì)其它5種（Geranyl acetate，Geraniol，α－Pinene，Limonene，F(xiàn)arnesyl hexanoate）有機(jī)溶劑的耐受性均有顯著提高，且生物燃料產(chǎn)量也大幅提高。

3 熱激蛋白

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSP）也被稱作分子伴侶，是細(xì)胞在外界物理化學(xué)刺激下產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，在胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和降解過程中起重要作用［17］。按照蛋白的大小，可分為5類，分別為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子熱激蛋白［18］。熱激蛋白最先是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，受熱刺激后合成量顯著增加，之后，發(fā)現(xiàn)其還能受溶劑、紫外線、機(jī)械損傷等誘導(dǎo)。

熱激蛋白在溶劑脅迫下，能夠阻止蛋白質(zhì)聚集，并協(xié)助其重新折疊，并最終提高耐受性［2］。目前，已經(jīng)在大腸桿菌、乳球桿菌、芽孢桿菌、假單胞菌、釀酒酵母等微生物中發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白的存在，而且不斷有人通過基因工程手段將熱激蛋白基因轉(zhuǎn)入溶劑生產(chǎn)菌中成功構(gòu)建溶劑耐受菌。Tomas等［19］發(fā)現(xiàn)熱激蛋白Gro－ESL過表達(dá)可以降低丁醇對(duì)C．a(chǎn)cetobutylicum的抑制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)GroESL過表達(dá)可以引起一系列熱激蛋白基因（包括dnaKJ、hsp18、hsp90）表達(dá)的提高。Zingaro等［20］在大腸桿菌中插入熱激蛋白基因構(gòu)建各種半合成脅迫應(yīng)答系統(tǒng)，同時(shí)超表達(dá)熱激蛋白GrpE和GroESL后，工程菌在5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇中24h后的活力是出發(fā)菌的3倍；同時(shí)超表達(dá)GroESL和ClpB共存質(zhì)粒后，工程菌在5%乙醇、1%正丁醇和1%異丁醇中24h后的活力較出發(fā)菌分別提高了1130%、78%和25%；同時(shí)超表達(dá)GrpE、Gro－ESL和ClpB的單質(zhì)粒后，工程菌在7%乙醇、1%正丁醇和25%1，2，4－丁三醇中24h后的活力較出發(fā)菌分別提高了200%、390%和78%。這些均表明熱激蛋白在微生物耐受性方面發(fā)揮著巨大的作用。

熱激蛋白基因的表達(dá)往往受特定的轉(zhuǎn)錄因子和σ因子的調(diào)控，其中最重要的是革蘭氏陰性菌中的σB和芽孢桿菌中的σS，但其具體調(diào)控機(jī)制還不清楚［17］?？偟膩?lái)說，熱激蛋白可以通過修復(fù)損傷蛋白質(zhì)而起到提高細(xì)胞耐受性對(duì)抗細(xì)胞死亡的作用，并且能有效提高生物燃料產(chǎn)量。

4 轉(zhuǎn)化與降解

在有毒溶劑進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞還會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的酶系，將有毒溶劑降解為低毒或無(wú)毒的小分子物質(zhì)，排出胞外或加以利用。P．putida DOT－T1E可以在90%（體積分?jǐn)?shù)）的甲苯培養(yǎng)基中生存，主要是因?yàn)榘麅?nèi)甲苯雙加氧酶將甲苯氧化成了3－甲基兒茶酚，并最終進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，通過降解甲苯，消除抑制作用，從而維持正常的生理代謝［12］。最近，Dai等［21］在 Clostridium acetobutylicumRh8菌株基因組中插入一個(gè)來(lái)自ClostridiumbeijerinckiiNRRL B593的次級(jí)醇脫氫酶基因（sADH），由thl啟動(dòng)子控制，發(fā)現(xiàn)該基因過表達(dá)后，Rh8的醇耐受性顯著提高，而且在以31．42%葡萄糖發(fā)酵過程中，總醇的產(chǎn)量也提高至23．88g·L－1（異丙醇7．6g·L－1、丁醇15g·L－1、乙醇1．28g·L－1）。這表明，相應(yīng)的降解酶系可以提高微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受能力，并最終提高生物燃料的產(chǎn)量，同時(shí)，也證明了基因工程手段在提高微生物耐受性的應(yīng)用中意義重大。

5 其它耐受機(jī)制

除了以上這些研究得較多的耐受機(jī)制外，耐受微生物中還存在一些報(bào)道較少的機(jī)制，像比表面積的改變、囊泡外排、脂多糖等。Neumann等［22］報(bào)道耐受菌P．putida P8在芳香族化合物（如苯酚、4－氯苯酚）存在時(shí)，其細(xì)胞體積明顯增大，且溶劑濃度越大，體積變化越顯著，同樣的情況在Enterobacter sp．VKG H12遇到正丁醇時(shí)也能觀察到。這說明，在遇到溶劑脅迫時(shí)，細(xì)胞能夠通過降低其比表面積以減少溶劑對(duì)胞體的傷害。另外，Kobayashi等［23］發(fā)現(xiàn) P．putida IH－2000在加有甲苯的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的囊泡，且囊泡會(huì)從細(xì)胞膜上釋放出來(lái)，囊泡中的甲苯濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞膜上的甲苯濃度，說明該菌通過形成囊泡將胞內(nèi)的有毒溶劑排出胞外。

微生物體內(nèi)存在多種耐受機(jī)制，這些機(jī)制往往不是單獨(dú)起作用，而是多種機(jī)制共同作用以應(yīng)付復(fù)雜的生存環(huán)境。Sandoval等［24］分別取有機(jī)溶劑存在時(shí)和不存在時(shí)的大腸桿菌基因組構(gòu)建文庫(kù)，分析后發(fā)現(xiàn)一系列與細(xì)胞膜和胞外進(jìn)程相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了變化，并產(chǎn)生特異的氨基酸和核苷酸，表明耐受性涉及多條途徑。多種耐受機(jī)制的存在，使細(xì)胞對(duì)溶劑的耐受性大大提高，保持了菌株的活性，一定程度上也提高了生物燃料的終產(chǎn)量。

6 結(jié)語(yǔ)

在生物燃料的生產(chǎn)過程中，產(chǎn)物的積累會(huì)抑制微生物和酶的活性，并最終影響其產(chǎn)量，應(yīng)對(duì)措施主要有兩個(gè)方面：一是及時(shí)從反應(yīng)器中除去產(chǎn)物以解除抑制作用，其方法主要包括氣提、液提、滲透蒸發(fā)、滲透萃取等；二是通過菌種篩選、菌種馴化、誘變、基因改造等方法提高菌種的耐受能力，使之能在高濃度的有機(jī)溶劑條件下正常生長(zhǎng)。微生物的有機(jī)溶劑耐受機(jī)制多種多樣，主要分為通過細(xì)胞膜的防御作用阻止毒性溶劑的進(jìn)入、通過輸出泵將已經(jīng)進(jìn)入胞內(nèi)的溶劑排出、通過胞內(nèi)降解酶系將未能及時(shí)排出的有毒溶劑分解等三個(gè)方面，因此，提高微生物有機(jī)溶劑耐受性的方法也可以從針對(duì)這三個(gè)方面著手，包括從高濃度溶劑污染的自然環(huán)境中篩選耐受菌，在宿主菌株中轉(zhuǎn)入相應(yīng)的熱激蛋白基因、輸出泵基因、高耐受性脂肪酸膜基因等以構(gòu)建新的高耐受性的工程菌等。

有機(jī)溶劑對(duì)微生物的作用并非絕對(duì)的，研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)臐舛认?，有機(jī)溶劑也能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，并最終提高生物燃料產(chǎn)量。例如，法尼烯等生化柴油和脂肪酸衍生物燃料在適當(dāng)?shù)臐舛认虏粫?huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)［2］；在釀酒酵母乙醇發(fā)酵過程中，低濃度的弱酸（＜100mmol·L－1）甚至可以提高乙醇得率，而在高于這一濃度時(shí)，乙醇得率則會(huì)降低［25］。

高有機(jī)溶劑耐受能力的菌株在生物燃料生產(chǎn)、生物修復(fù)、生物醫(yī)藥、污水處理、酶制劑開發(fā)、全細(xì)胞生物催化等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，但溶劑輸出泵的具體作用機(jī)制、革蘭氏陽(yáng)性菌的耐受機(jī)制等相關(guān)研究都還需要進(jìn)一步的深入。

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