周海霞，劉其友，鄭經(jīng)堂

（中國石油大學(xué)（華東）化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島266580）

氮元素是海洋初級生產(chǎn)力的主要限制因素。海洋中氮元素的補(bǔ)充有三條途徑：（1）陸源輸入，氮營養(yǎng)鹽從土壤中被溶淋出，經(jīng)由河流、湖泊進(jìn)入海洋生態(tài)系統(tǒng)。這一過程主要影響河口地區(qū)和近海，增加水體等的富營養(yǎng)化；（2）空氣中的氮經(jīng)過閃電和宇宙射線輻射轉(zhuǎn)化為少量可溶性氨；（3）海洋微生物的固氮作用，即海洋微生物在固氮酶作用下將N2催化還原為。具有固氮作用的微生物不僅能夠通過固定N2來支持自身生長，還能通過細(xì)胞分泌等過程向環(huán)境釋放結(jié)合態(tài)氮，從而緩解周圍的氮限制[1］。在海洋環(huán)境中，微生物固氮作用經(jīng)過長期進(jìn)化給海洋環(huán)境提供了新的氮源，對于增加寡營養(yǎng)海域的新生產(chǎn)力具有重要生物學(xué)意義。

1 海洋固氮微生物的種類

隨著人們對固氮微生物研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)了越來越多的新的種類。從最初的只能檢測到個別微生物具備固氮能力，發(fā)展到利用乙炔還原法和同位素標(biāo)記[2］檢測許多微生物能夠進(jìn)行固氮，直至利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測固氮酶基因nifH或nifHmRNA，極大地拓展了人們對固氮微生物多樣性和固氮活性的認(rèn)識。目前已知的固氮微生物均屬于古菌域和細(xì)菌域[3］，還沒有發(fā)現(xiàn)能進(jìn)行固氮的真核微生物。根據(jù)微生物的生理特點和生物種類，可將固氮微生物分為不同的生理類群和生物類群。

1.1 固氮微生物的生理類群

按照固氮菌和其它生物的生理關(guān)系，可將固氮微生物分為三種主要生理類型[4，5］：自生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌。固氮是厭氧過程，但某些微生物在固氮的同時仍然產(chǎn)生氧氣，按照微生物在固氮時是否有氧氣產(chǎn)生，還可將自生固氮菌分為好氧性自生固氮菌和厭氧性自生固氮菌。

自生固氮菌是能夠獨立生活并固氮的微生物。1961年，Dugdale等[6］進(jìn)行海洋Trichodesmium 固氮研究，通過示蹤證實了它具有固氮能力。后續(xù)研究表明Trichodesmium是海洋中重要的固氮微生物之一。

聯(lián)合固氮菌是能夠獨立生活的固氮微生物，通過定植于植物根系表面或附近土壤或侵入植物根部，依靠植物根系分泌物生長，同時提供固定的氮滿足植物生長需要，二者形成松散的共生關(guān)系。海草Zostera marina根系周圍的沉積物能夠刺激微生物固氮活性，再通過氮轉(zhuǎn)移獲得海草生長需要的氮源。固氮微生物和海草的生長之間是相互促進(jìn)的關(guān)系，研究表明多糖和藻酸鹽等能夠使沉積物固氮速率提高幾倍到上百倍[7，8］。

共生固氮菌是必須和另一種生物密切生活在一起才能進(jìn)行固氮的微生物，二者生存關(guān)系密切，單獨生活時不能進(jìn)行固氮。固氮菌通過固定氮獲得氨基酸和蛋白質(zhì)，然后提供給共生生物，同時從共生生物那里獲得必需的碳源和能源[9］。能與固氮微生物共生的海洋生物有珊瑚、海綿、船蛆、硅藻等[10］。

1.2 固氮微生物的生物類群

Zehr等[3］在2003年將含有nifH 固氮基因的微生物進(jìn)行分類整理，得到10個門或者綱（Group），共67個屬，廣泛分布在原核微生物中。這說明固氮能力對微生物來說十分重要。Dos Santos等[11］用6種固氮酶基因編碼的產(chǎn)物NifHDK和NifENB搜索所有的微生物基因組序列，結(jié)果獲得13個細(xì)菌門和1個古菌門，共109個屬，149個種，其中82個種是已知的固氮微生物，67個種固氮能力未知。作者從GenBank中搜索含有nifH基因的微生物，共得到116個屬，比Zehr等[3］在2003年統(tǒng)計的固氮微生物種屬增加了近1倍，這說明10年間人們對固氮微生物的研究取得了前所未有的進(jìn)步。

2 固氮基因的多樣性

PCR技術(shù)推動了微生物生態(tài)研究走向分子階段。該技術(shù)不依賴于活的微生物，更不需要檢驗微生物的功能活性。采用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量未知的不可培養(yǎng)微生物。對極端環(huán)境、海洋水體、深海沉積物以及甲烷水合物區(qū)的固氮基因nifH的研究，極大地豐富了人們的視野，加深了對固氮微生物和氮循環(huán)重要性的認(rèn)識，使人類對固氮微生物的了解從膚淺走向深入。

固氮酶橫跨古菌域和細(xì)菌域，分布極其廣泛，說明固氮功能在微生物中普遍存在，同時也說明這一功能的重要性。固氮基因廣泛存在但是進(jìn)化上卻具有保守性，為采用PCR技術(shù)擴(kuò)增固氮基因nifH、分析環(huán)境中大量存在的不可培養(yǎng)的固氮微生物奠定了基礎(chǔ)。隨著研究的深入，對NifH系統(tǒng)發(fā)育多樣性的認(rèn)識也逐步增加。2003年，Zehr等[3］通過構(gòu)建 NifH 和16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹對固氮基因和微生物種群進(jìn)行比較，認(rèn)為固氮基因和固氮微生物種類存在一定程度上的一致性，在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以找出一一對應(yīng)關(guān)系。

早期的研究認(rèn)為，nifH基因基本上有4個Cluster，Cluster I基因主要來自α－變形菌綱、β－變形菌綱、γ－變形菌綱、藍(lán)細(xì)菌以及γ－變形菌綱的vnfH 基因；ClusterⅡ是產(chǎn)甲烷微生物的固氮酶和細(xì)菌anfH基因；ClusterⅢ是厭氧細(xì)菌的固氮酶基因，例如梭菌（G＋C含量低，G＋）、硫還原細(xì)菌（δ－變形菌綱）；ClusterⅣ是各種來自古菌的固氮酶基因，和16SrDNA的分類有一定的相似性[3，12］。

2003年，Mehta等[12］用nifH 基因的一對擴(kuò)增引物：正向引物forward（5′－GGHAARGGHGGHATHGGNAARTC－3′，對應(yīng)10～17位氨基酸 GKGGIGKS，是鐵蛋白上ATP的結(jié)合位點）和反向引物reverse（5′－GGCATNGCRAANCCVCCRCANAC－3′，對應(yīng)132～139位氨基酸VCGGFAMP，包含4Fe－4S簇配位體上的半胱氨酸），從深海和熱液噴口獲得的77個NifH，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示也分成4個簇。

2004年，Steward等[13］用兩對引物：CDHPnif53F（5′－TGAGACAGATAGCTATYTAYGGHAA－3′）和CDHPnif723R（5′－GATGTTCGCGCGGCACGAADTRNATSA－3′），以及nifH2（5′－TGYGAYCCNAARGCNGA－3′）和 nifH1（5′－ADNGCCATCATYTCNCC－3′），進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，獲得228條序列；以獲得的序列加上當(dāng)時GenBank中的219條序列，共447條序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示出一支獨立于已知4個Cluster的深海簇（Deep branches）。

2009年，Dang等[14］用Mehta設(shè)計的固氮基因引物[12］對鄂霍次克海水合物區(qū)2個站位的沉積物樣品進(jìn)行擴(kuò)增，克隆出的nifH基因多樣性更加豐富，其中新分離出的ClusterⅤ是當(dāng)時該地區(qū)特有的固氮基因簇。

2013年，Dang等[15］還是用同一對固氮基因引物，對中國南海從幾百米到上千米深度不同的12個站位沉積物樣品進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1110個不同的DNA序列，分別屬于α－變形菌綱、β－變形菌綱、γ－變形菌綱、δ－變形菌綱、厚壁菌門、綠菌綱、擬桿菌門、疣微菌門和廣古菌門，這些序列與已知序列的相似性為40.1%～100%。此次南海nifH擴(kuò)增分出了9個大的Class，體現(xiàn)了固氮微生物更高的多樣性[15］。

3 不同海洋生態(tài)環(huán)境的微生物固氮

微生物通過固氮為海洋提供了大量的新氮。2002年，估算的全球海洋氮固定能力為100～200Tg N·a－1，即每年100×1012～200×1012g N[16］。這些清潔氮源對維持海洋初級生產(chǎn)力具有重要意義。分子生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，從表層海水到大洋深處沉積物，固氮微生物的類群分布具有一定規(guī)律，并不是雜亂隨機(jī)的。真光層上部表層水體中分布的是自由生活或內(nèi)共生的藍(lán)細(xì)菌門和γ－變形菌綱；靠近表層出現(xiàn)的多是α－、β－、γ－、δ－變形菌綱和綠菌門；海洋水體深處中存在的一般是α－、γ－變形菌綱以及古菌；海草和鹽沼生態(tài)系統(tǒng)中常為變形菌綱、厚壁菌門；沉積物中主要是變形菌綱，深海沉積物中還擴(kuò)增得到眾多古菌[17］。

3.1 深海的固氮微生物

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海底的冷泉、熱泉、火山口和水合物區(qū)都存在高密度的微生物。對這些地區(qū)固氮微生物的探索主要采用分子生物學(xué)方法。2005年開展的深海調(diào)查計劃 Leg 201of the Ocean Drilling Program at Site 1230，在鄰近水合物區(qū)的沉積物柱狀樣品中發(fā)現(xiàn)了由微生物群落支持的生態(tài)系統(tǒng)，分離出了可能的固氮微生物Rhizobia和Vibrio diazotrophicus[18］。

Mehta等[12］用固氮基因引物擴(kuò)增位于太平洋東北部胡安德富卡洋中脊（Juan de Fuca Ridge）附近的Axial Volcano和Puffer兩個受火山活動影響的熱液噴口，得到約400bp長的固氮基因片段，從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析得出主要的nifH克隆分布在ClusterⅡ、ClusterⅢ和ClusterⅣ三個簇。這表明深海熱液環(huán)境固氮基因具有多樣性，又因為其獨特的地理位置而具有特殊性。而所有來自深海樣品的nifH基因都與嗜熱的厭氧古菌Methanococcus thermolithotrophicus有77%～83%的一致性，表明深海熱液噴口nifH基因有兩個來源，一個是厭氧高溫海床，另一個是冷的富氧深水[12］。

對深海水合物環(huán)境中的固氮微生物研究，將海底的氮循環(huán)、碳循環(huán)以及硫循環(huán)緊密聯(lián)系在一起。水合物區(qū)的厭氧甲烷氧化古菌（Anaerobic methane oxidizing archaea，ANME）和硫還原細(xì)菌（Sulfate－reducing bacteria，SRB）之間廣泛存在合作共生關(guān)系[19］。甲烷氣體的溫室作用比CO2更強(qiáng)，ANME和SRB的共生關(guān)系減少了甲烷氣體從海洋向大氣的釋放，也正由于這種共生關(guān)系使得ANME至今不能純培養(yǎng)，只能采用分子手段研究其生理生化特點[19］。淺表水合物支撐深海環(huán)境中生物群落和生產(chǎn)力，這種生態(tài)系統(tǒng)對氮源有大量需求?；瘜W(xué)分析表明，硝酸鹽和亞硝酸鹽在深海熱液噴口處濃度僅為40μmol·L－1，在高于30℃的還原性水體中更加缺乏，而氨在深海和冷泉的濃度小于1μmol·L－1，海洋中最大的氮源是氮氣，在深海中濃度能達(dá)到0.59mmol·L－1[20］。微生物固氮能給碳源豐富、氮源缺乏的甲烷溢出環(huán)境提供氮源。深海Eel River Basin海盆固氮酶宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，主要的固氮酶來自Deltaproteobacteria和Methanosarcina，隨后直接標(biāo)記檢測證明ANME和SRB甲烷氧化共生體存在固氮能力，這一發(fā)現(xiàn)說明這兩類微生物對深海水合物區(qū)新氮的輸入具有重要作用，固氮是一個普遍現(xiàn)象，甲烷氧化聯(lián)合體（Methane－oxidizing consortia）可能直接參與了氮固定[19］。從甲烷溢出環(huán)境分離到的甲烷氧化古菌（GenBank：AB362194）基因上含有一個固氮酶操縱子，支持了甲烷氧化聯(lián)合體固氮假說[19］。目前的數(shù)據(jù)表明ANMEs被分成3種系統(tǒng)發(fā)育類型，其中 ANME－2、ANME－3與δ－變形菌綱的SRB微生物形成共生，ANME－1則單獨進(jìn)行甲烷氧化[21－25］。

Dang等[14］對鄂霍次克海水合物區(qū)沉積物固氮酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增表明，這一地區(qū)有著獨特的nifH 基因，并且大部分的序列來自于沒有培養(yǎng)的和未知的細(xì)菌或古菌。用 PCoA（Principal coordinates analysis）分析熱液噴口、深海甲烷溢出環(huán)境和海水的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)表明，表面海水、熱液噴口附近、水合物區(qū)的固氮微生物是3個差異很大的群落，進(jìn)一步表明環(huán)境特點強(qiáng)烈影響到固氮微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)。

3.2 近海的固氮微生物

微生物固氮的同時吸收CO2，因此固氮影響著海洋碳的輸入輸出。了解海洋固氮微生物對定性和定量預(yù)測固氮對碳循環(huán)和全球碳變化的影響十分重要[26］。地表徑流以及大氣沉降[27，28］攜帶各種物質(zhì)進(jìn)入海洋，包括高濃度的無機(jī)氮和各種微量元素等，再加之近岸海水較淺、有利于光合作用等因素，使得靠近大陸的海洋微生物豐度和多樣性比深?；蚬褷I養(yǎng)海域都更加豐富。對近?；蛘叽箨戇吘壓５墓痰芯?，研究對象基本分為水體和沉積物，這是兩種完全不同的固氮生態(tài)環(huán)境。海水中的氮固定以固氮藍(lán)細(xì)菌為主導(dǎo)[27］，特別是單細(xì)胞固氮藍(lán)細(xì)菌巨大固氮能力的發(fā)現(xiàn)[29，30］，改變了以Trichodesmium為主研究海洋水體固氮的格局。

近海和河口地區(qū)一般被看作是由反硝化作用造成的氮凈損失區(qū)[31］，營養(yǎng)鹽特別是銨鹽豐富，對固氮有抑制作用[32］，因此有學(xué)者認(rèn)為這些地區(qū)固氮作用不是十分重要。但是在海草生長區(qū)、珊瑚礁、紅樹林等海域，甚至是這些生態(tài)區(qū)外的沉積物固氮研究顯示固氮作用是存在的[33］，如果忽略這些確實存在的固氮作用，那么就很難正確研究近海的氮平衡問題。

紅樹林、珊瑚礁和海草床等是近岸海洋生態(tài)功能區(qū)，也是固氮研究的熱門區(qū)域。紅樹林能起到防風(fēng)防浪的作用，是有重要防護(hù)作用的熱帶和亞熱帶海洋生態(tài)系統(tǒng)。我國沿岸的這些生態(tài)功能區(qū)基本處于不健康或者亞健康狀態(tài)[34］。Zhang等[35］對我國三亞地區(qū)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的固氮微生物采用不依賴于培養(yǎng)的PCR－DGGE（Denaturing gradient gel electrophoresis）技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)主要的固氮微生物類群為：Azotobacter、Desulfuromonas、Sphingomonas、Geobacter、Pseudomonas、Bradyrhizobium 和Derxia；CCA（Ca－nonical correspondence analysis）分析顯示有機(jī)碳和鉀是影響微生物群落分布的主要因素。Dias等[36］對巴西圣保羅州的兩個紅樹林生態(tài)區(qū)（其中一個受石油開采影響、另一個不受影響）進(jìn)行固氮基因nifH 的研究，發(fā)現(xiàn)這兩個地區(qū)的nifH的豐度相當(dāng)，但是物種分布不同，與石油污染的影響有關(guān)。Vovides等[37］對位于墨西哥南下加利福尼亞州的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)查，通過乙炔法測定保護(hù)區(qū)、重新種植區(qū)、自然生長區(qū)、遭受破壞區(qū)四種狀態(tài)下的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的淤泥微生物固氮作用，發(fā)現(xiàn)未受破壞的三種紅樹林生態(tài)系統(tǒng)之間的固氮差異不顯著（39～47mg N·m－2·a－1），但與遭受破壞的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)比較差異顯著，是遭受破壞的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)固氮能力的7～8倍；遭受破壞的紅樹林泥樣中較高的鹽度和pH值可能影響了微生物固氮作用，微生物固氮功能起到了指示紅樹林健康狀況的作用。

4 固氮作用研究的新視角

一直以來人們總是從緩解海洋環(huán)境氮限制角度探討微生物固氮作用，偏重于寡營養(yǎng)和遠(yuǎn)洋海域的固氮作用研究。近年來隨著研究的深入，人們逐漸意識到固氮作用對近岸環(huán)境也具有重要的生態(tài)學(xué)意義，從新的視角開展了固氮研究。

4.1 固氮微生物對環(huán)境的指示作用

沉積物質(zhì)量的改變必將影響棲居其中的微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及活性。例如紅樹林毀壞后，鹽度和pH值升高使微生物固氮活力下降，固氮微生物起到了指示紅樹林健康狀況的作用[37］。史氏甲烷短桿菌（Methanobrevibacter smithii）是廣泛生活在人腸道中的產(chǎn)甲烷廣古菌，環(huán)境再生長的可能性很低，擁有獨特的nifH 基因，2011年，Johnston等[38］用該古菌的nifH基因指示水體污染，論證了這一方法的可行性。這些研究都提到了固氮微生物的環(huán)境指示作用，為固氮微生物研究提供了新思路。

4.2 富營養(yǎng)環(huán)境固氮微生物的研究意義

在人類活動影響氮循環(huán)之前，氮元素一直是生物生長的限制因素?；使I(yè)的出現(xiàn)和發(fā)展推動了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，卻人為地加快了氮固定的速率，加速更多不可利用的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成生物可利用的氨，人類對空氣中氮的固定超過了地球自然固氮的總和[39］。過量使用化肥導(dǎo)致可溶解的氮營養(yǎng)鹽隨著雨水沖刷和陸地徑流最終進(jìn)入到海洋，必將打破原有的氮循環(huán)平衡狀態(tài)。接踵而來的是受全球氮循環(huán)改變引起的一系列危機(jī)，例如：對海洋特別是近岸海域原有固氮作用和氮循環(huán)的相關(guān)微生物產(chǎn)生重要的影響，導(dǎo)致生物多樣性發(fā)生變化；外源營養(yǎng)鹽增多，導(dǎo)致生物固氮能力降低，同時對CO2的固定能力降低，最終使得氣候變暖；氮鹽輸入經(jīng)常引起水體富營養(yǎng)化，使得水質(zhì)變差，威脅水生生物生長甚至死亡，這些后果都將造成人類生存危機(jī)[40］。也使得近岸富營養(yǎng)化海域的固氮微生物生態(tài)研究呈現(xiàn)出新的意義。

5 結(jié)語

固氮微生物和固氮基因在海洋環(huán)境中廣泛存在，種類豐富。近年來人們應(yīng)用新技術(shù)從多角度多方位對海洋固氮作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)固氮基因分布和環(huán)境因子具有相關(guān)性，對環(huán)境具有一定的指示意義，但是相關(guān)研究仍然欠缺。對近岸海洋固氮作用的研究揭示了近海固氮存在的一些區(qū)別于傳統(tǒng)觀念的現(xiàn)象，使得人們重新認(rèn)識固氮微生物的生態(tài)作用，同時開辟了固氮基因分子生態(tài)學(xué)研究的新視角。

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