石雅麗， 張 銳， 任茂智， 孟志剛， 周 燾， 孫國清， 孟釗紅， 郭三堆

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

棉花雄性不育的研究進(jìn)展

石雅麗， 張 銳， 任茂智， 孟志剛， 周 燾， 孫國清， 孟釗紅， 郭三堆?

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

棉花在產(chǎn)量、品質(zhì)、生理生化特性等不同的性狀上均具有明顯的雜種優(yōu)勢。棉花雄性不育在棉花雜種優(yōu)勢的利用上具有重要作用，棉花雄性不育可以突破傳統(tǒng)人工去雄雜交育種的瓶頸，為棉花雜交種制種的商業(yè)化推廣展現(xiàn)了光明的前景。綜合目前棉花雄性不育的研究成果，本文介紹了棉花雄性不育系的類型，綜述了其細(xì)胞學(xué)特征、分子機(jī)理，以及相應(yīng)培育方法，同時分析了目前存在的問題，并對雄性不育系的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

棉花；雄性不育；雜種優(yōu)勢

棉花是一種重要的天然纖維作物，而棉鈴則是體現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)價值的重要器官，因此對棉花的生殖發(fā)育機(jī)制進(jìn)行研究，特別是對雄蕊的發(fā)育機(jī)制的研究，對培育棉花新品種、促進(jìn)棉花產(chǎn)業(yè)更快發(fā)展都具有非常重要的意義。

目前，雜交棉的種植面積逐年遞增。據(jù)統(tǒng)計(jì)［1］，20世紀(jì)90年代初雜交棉種植面積僅占全國棉花種植面積的0．3%，到90年代末為10．8%，到2006年全國雜交棉種植面積達(dá)179萬hm2，占棉花播種面積的33．2%。雜交棉現(xiàn)已成為生產(chǎn)中的主要棉花品種，在我國長江流域棉區(qū)已基本普及，黃河流域及新疆棉區(qū)正在大力發(fā)展。在應(yīng)用雜交棉進(jìn)行雜交制種方面，棉花雄性不育系具有很強(qiáng)的應(yīng)用價值。這是因?yàn)樾坌圆挥s交種的推廣有很多優(yōu)勢，如：省去人工去雄和降低制種成本。但目前，由于高優(yōu)勢組合較少，制約著不育系在生產(chǎn)上的大面積應(yīng)用。因而，深入研究雄性不育的分子機(jī)理以及雜種優(yōu)勢的形成機(jī)制，可促進(jìn)棉花雄性不育雜交種的大面積應(yīng)用。

1 棉花雄性不育的主要類型

植物雄性不育是指兩性花植物的雄蕊喪失功能的現(xiàn)象，主要特征為雄蕊不能產(chǎn)生可育的花粉，而雌蕊發(fā)育正常，可以通過授粉結(jié)實(shí)。雄性不育的性狀有些是由遺傳因素控制的，包括細(xì)胞核雄性不育和細(xì)胞質(zhì)雄性不育兩類；有些是由外界環(huán)境因素（如光、溫度、化學(xué)試劑等）導(dǎo)致的。

1．1 細(xì)胞核雄性不育（genom e male sterility，GMS）

植物核雄性不育是由細(xì)胞核內(nèi)染色體上的不育基因所決定的雄性不育，其遺傳方式遵循孟德爾遺傳規(guī)律。核雄性不育系由核基因控制，有隱性和顯性兩種，主要為單基因控制。目前已發(fā)現(xiàn)17種不同基因類型的核雄性不育系［2］。

1．2 細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasm ic male sterility，CMS）

植物胞質(zhì)雄性不育是由胞質(zhì)基因和核基因共同控制的不育類型，因而又稱為核質(zhì)互作雄性不育。根據(jù)胞質(zhì)來源不同，細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的類型主要有哈克尼西棉胞質(zhì)不育系（D2-2）、亞洲棉（A2）胞質(zhì)不育系、異常棉（B1）胞質(zhì)不育系、三裂棉胞質(zhì)不育系（D8）、陸地棉（AD1）胞質(zhì)不育系和海島棉胞質(zhì)不育系（AD2）。目前，已育成的不育系有：哈克尼西棉胞質(zhì)不育系DES?HAms16和DES?HAms277［3］；亞洲棉胞質(zhì)不育系P24?6A［4］；三裂棉胞質(zhì)不育系D8ms［5］；陸地棉胞質(zhì)不育系晉A［6］和 104?7A［7，8］；海島棉胞質(zhì)不育系湘遠(yuǎn)A［9］等。

1．3 生態(tài)敏感型雄性不育

生態(tài)敏感型雄性不育是指花粉育性受環(huán)境控制。根據(jù)對光、溫反映的不同還可劃分為3種類型：溫敏型、光敏型和溫光互作型。其中，以溫度影響最為顯著。由于生態(tài)敏感型雄性不育受環(huán)境和遺傳雙因素控制，其分子機(jī)理很復(fù)雜，因此有關(guān)生態(tài)敏感型雄性不育的相關(guān)報道較少。

2 棉花雄性不育的細(xì)胞學(xué)特征

2．1 核雄性不育系中的小孢子敗育

小孢子的發(fā)育過程要經(jīng)過復(fù)雜的生理生化變化，在這個過程中，不同發(fā)育時期伴隨著不同基因的時空表達(dá)差異，而這個過程中的任何一個相關(guān)基因的突變，都會直接或間接影響小孢子的發(fā)育。因此，對于棉花核雄性不育系，小孢子敗育會發(fā)生在小孢子發(fā)育的整個過程，敗育時期和特征的差別僅僅因材料而不同。

已報道過的棉花核雄性不育系中小孢子敗育的時期和特征主要有4種類型：①造孢細(xì)胞時期：核仁增大、胞質(zhì)液化、細(xì)胞形態(tài)畸形。②花粉母細(xì)胞時期：核仁穿壁，花粉母細(xì)胞中有多個核仁，在減數(shù)分裂前期Ⅰ后就退化解體，小孢子母細(xì)胞呈半月形，如ms8ms9的敗育現(xiàn)象［10］。③單核期：胼胝質(zhì)壁在減數(shù)分裂期后就溶解，小孢子外壁不出現(xiàn)刺突，原生質(zhì)體質(zhì)壁分離，隨后核膜溶解，細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)解體，如陸地棉 1355A （ms2）［11］和473A（ms14）［12］不育系。④雙核期：小孢子產(chǎn)生的生殖細(xì)胞緊貼于小孢子內(nèi)壁，產(chǎn)生的營養(yǎng)細(xì)胞與花粉粒原生質(zhì)體一起皺縮，隨后兩種細(xì)胞都解體，如：ms5ms6不育系［13］。

2．2 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中的小孢子敗育

姚長兵等［14］對哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的小孢子母細(xì)胞發(fā)育過程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其可以形成正常的孢原細(xì)胞、造孢細(xì)胞以及小孢子母細(xì)胞，藥壁分化正常，但在減數(shù)分裂前期，絨氈層提前解體，小孢子母細(xì)胞隨即退化。由于絨氈層是小孢母細(xì)胞的營養(yǎng)源，所以推測棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中小孢子母細(xì)胞敗育可能與絨氈層的提前解體有關(guān)。黃晉玲等［15］發(fā)現(xiàn)晉A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系敗育的主要時期是在造孢細(xì)胞增殖期，即小孢子母細(xì)胞形成時期，其主要細(xì)胞學(xué)特征是：造孢細(xì)胞胞內(nèi)常有多個微核，不能進(jìn)行正常的有絲分裂，小孢子母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)液泡化，最終造孢細(xì)胞和小孢子母細(xì)胞提前退化，因此推測小孢子母細(xì)胞的敗育與絨氈層的退化密切相關(guān)。武小平［16］對104?7A起源的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A小孢子發(fā)育進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)P30A敗育主要發(fā)生在花粉母細(xì)胞形成階段，其主要的細(xì)胞學(xué)特征是：孢原細(xì)胞分化正常，有大量的初期花粉母細(xì)胞產(chǎn)生，但隨后花粉母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)液泡化，原生質(zhì)緊縮，核仁消失，最后細(xì)胞解體，同時在花藥發(fā)育的過程中沒有明顯的絨氈層細(xì)胞形成，成熟花藥的藥室全部充滿了破裂的花粉母細(xì)胞內(nèi)含物以及藥室內(nèi)壁物質(zhì)。上述研究均證明花粉敗育與絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常有關(guān)。

綜合以上研究結(jié)果，細(xì)胞質(zhì)雄性不育的敗育時期多集中在早期，主要是造孢細(xì)胞時期和減數(shù)分裂時期，造孢細(xì)胞時期特征為有絲分裂異常；減數(shù)分裂時期特征為花粉母細(xì)胞胞質(zhì)液泡化，隨即解體。同時在多個細(xì)胞質(zhì)不育系中觀察到絨氈層較早退化，絨氈層作為小孢子發(fā)育的營養(yǎng)源，其較早解體必將導(dǎo)致小孢子發(fā)育異常。因此，胞質(zhì)不育較徹底可能與絨氈層提前退化密切相關(guān)。

3 棉花雄性不育的分子機(jī)理

3．1 核雄性不育的分子機(jī)理研究

3．1．1 核雄性不育的基因表達(dá)差異分析 比較雄性不育與可育的基因表達(dá)差異，是研究核雄性不育分子機(jī)理的重要方面。Ma等［17］對比了棉花ms5ms6雙隱性核雄性不育的可育株和不育株的花粉發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)造孢細(xì)胞時期、小孢子母細(xì)胞時期和花粉粒時期有17個差異表達(dá)片段，分屬11種表達(dá)模式，可能參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與能量代謝等相關(guān)過程。侯磊等［18］對洞A雄性不育和可育棉花中花粉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不育和可育花粉cDNA?AFLP的譜帶在單核期的差異大于減數(shù)分裂期，而在花粉發(fā)育早期即花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂期，不育株中基因的表達(dá)減少，而且有些條帶雖未消失，但表達(dá)量下降了；與可育株相比，隨著花粉花藥的發(fā)育，不育株在花藥表型上的異常越來越明顯；在花粉成熟期，產(chǎn)生花藥中無花粉的現(xiàn)象。

3．1．2 核雄性不育相關(guān)基因 根據(jù)遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，張?zhí)煺娴龋?9］發(fā)現(xiàn)陸地棉核不育系1355A的不育性狀是 ms2單基因控制的，因此1355A是研究核不育的重要材料。隨后，王國英等［20］以1355A為材料，在F2群體中分別構(gòu)建了可育系與不育系的DNA池，獲得了40對（32對SSR、8個SRAP組合）多態(tài)性引物。連鎖分析顯示，3個SSR標(biāo)記（4個多態(tài)性位點(diǎn)）與雄性不育基因緊密連鎖。標(biāo)記BNL3932800和BNL3932870距離ms2分別為1．56 cM和2．08 cM，位于ms2另一端的BNL236和CIR295遺傳距離分別是3．23 cM和4．76 cM。根據(jù)棉花基因組圖譜將該基因定位在14號染色體上，從而實(shí)現(xiàn)了陸地棉雄性核不育基因ms2的首次精細(xì)定位。

目前，已克隆到多個參與棉花雄蕊發(fā)育或雄蕊特異性表達(dá)的核基因。例如，MADS?Box蛋白基因是一類轉(zhuǎn)錄因子，在棉花花分化早中期參與雄蕊發(fā)育，包括 GhMADS1［21］、GhMADS3［22］和GhMADS?13［23］等，其中GhMADS1編碼236個氨基酸，在陸地棉的花瓣、雄蕊、胚珠和纖維中表達(dá)，而在根、莖、葉等營養(yǎng)器官和棉花同源異型突變體CHV1（所有花器官均變?yōu)榘~狀葉性器官）的變異花蕾中不表達(dá)；GhMADS3主要在棉花的雄蕊和心皮中表達(dá)；GhMADS?13在棉花花發(fā)育早中期表達(dá)量逐步增加，后期有下降趨勢，同時在雌蕊和雄蕊中表達(dá)量較高，推測GhMADS?13可能在開花誘導(dǎo)和花器官發(fā)育過程中起著重要作用。2009年，Wang等［24］通過熒光定量PCR和Northern雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)?；o酶A合成酶1基因（GhACS1）在棉花雄蕊分化的整個過程都有表達(dá)，在花藥尤其是絨氈層分化中優(yōu)勢表達(dá)，原位雜交實(shí)驗(yàn)表明GhACS1在初生造孢細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞中表達(dá)，GhACS1的活性對于初生造孢細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞中脂肪酸代謝起重要作用，抑制該基因的表達(dá)會在花藥發(fā)育早期影響絨氈層發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育，因此GhACS1基因在棉花花藥發(fā)育早期的小孢子發(fā)生過程中起作用，而且可能參與小孢子正常分化與發(fā)育。在成熟花粉中還發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)的基因還有多聚半乳糖醛酸酶（polygalactu?ronase，PG）和第三類過氧化物酶（peroxidase，POD）基因。John等［25］研究發(fā)現(xiàn)PG基因在棉花花藥發(fā)育后期開始表達(dá)，到成熟花粉粒時達(dá)到最大量，并且為花粉特異表達(dá)基因，表明該基因參與花藥發(fā)育后期事件，與花粉成熟密切相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)棉花中的一個花特異POD基因在花粉中優(yōu)勢表達(dá)，可能參與被子植物的雄蕊發(fā)育；同時一些棉花中的ClassⅢ過氧化物酶基因只在花粉中表達(dá)，表明它是棉花雄性生殖發(fā)育中的脅迫應(yīng)答因子［26］。

綜上所述，花粉發(fā)育的過程中表達(dá)的基因參與了多個生理生化反應(yīng)，如激素調(diào)節(jié)、能量變化和代謝調(diào)控等。這些基因的表達(dá)具有時空性，有些基因則具有特異性。

3．2 胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理研究

3．2．1 胞質(zhì)雄性不育分子機(jī)理及應(yīng)用 根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，目前公認(rèn)的胞質(zhì)不育形成機(jī)制為：一方面胞質(zhì)中線粒體或葉綠體基因組中的基因發(fā)生了突變或分子重排，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)不能發(fā)揮功能，造成植物不育；另一方面是胞質(zhì)線粒體基因發(fā)生分子重排，其產(chǎn)物影響了線粒體的正常功能，進(jìn)而花粉發(fā)育受阻，最終導(dǎo)致雄性不育。王學(xué)德等［10］以哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系為研究對象，發(fā)現(xiàn)不育系中缺少一條分子質(zhì)量約為31 kDa的多肽片段，線粒體DNA缺少1條1．9 kb的片段，該片段與COX1基因具有同源序列，推測胞質(zhì)雄性不育可能是由于線粒體基因組發(fā)生突變或重排，造成COX1基因的變異引起的。黃晉玲［27］以陸地棉晉A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系為研究對象，也發(fā)現(xiàn)在線粒體基因atp6和COX1基因的雜交帶中，不育系分別缺少5．7 kb和4．2 kb的強(qiáng)雜交帶。同時，Christine［28］發(fā)現(xiàn)目前至少有14個線粒體基因與細(xì)胞質(zhì)不育有關(guān)，它們的共同特征是基因的開放閱讀框由已知線粒體基因的編碼序列、已知基因的側(cè)翼序列和未知區(qū)域的序列共同組成。蔣培東［29］研究了哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)理，推測線粒體中coxⅢ基因的突變和線粒體結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈異常，活性氧清除酶活性和抗氧化酶降低，從而使花藥中積累大量的應(yīng)激活性氧，對細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生了毒害。黃晉玲［27］在酶切基因組DNA后發(fā)現(xiàn)二者有8個多態(tài)性的葉綠體CAPS標(biāo)記。2009年，馬勇等［30］以哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的敗育高峰期——花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂之前的花藥和同型保持系相同時期的花藥為材料，利用cDNA?AFLP技術(shù)進(jìn)行差異片段分析，其中差異片段有在不育系中上調(diào)（或特異）表達(dá)的基因，也有在保持系中上調(diào)（或特異）表達(dá)的基因，這些差異基因主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、能量代謝、RNA編輯、細(xì)胞程序化死亡和雄配子發(fā)育等相關(guān)過程。因此，通過研究不育系和保持系在葉綠體和線粒體基因組結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物方面的差異，證實(shí)棉花胞質(zhì)雄性不育系的形成原因可能存在于線粒體和葉綠體的遺傳系統(tǒng)中，尤其是線粒體。

由此，張曉等［31］開發(fā)出可鑒定棉花可育胞質(zhì)與不育胞質(zhì)的3個分子標(biāo)記，分別是 SSR160、SCAR515和SCAR555。其中SSR160是線粒體基因atpA RFLP片段3′端的一個SSR位點(diǎn)，在可育胞質(zhì)中為（TAA）7（TA）6，在哈克尼西棉CMS系（CMS?D2）、陸地棉和海島棉的不育胞質(zhì)中是（TAA）3（TA）2，而在三裂棉CMS系（CMS?D8）胞質(zhì)中是（TAA）4（TA）3；SCAR515和SCAR555是atpA截短型拷貝RFLP片段上可育胞質(zhì)與不育胞質(zhì)中分別存在一段515bp和555bp的差異序列，而且這兩條差異序列完全不同。由于三裂棉CMS系（CMS?D8）胞質(zhì)與其他CMS系的差異，張曉等［31］根據(jù)SNP位點(diǎn)，開發(fā)出CMS?D8特異分子標(biāo)記SCARD8。

3．2．2 育性恢復(fù)機(jī)理研究 研究細(xì)胞質(zhì)雄性不育系機(jī)理的目的，除了尋找不育基因外，還為了研究恢復(fù)基因?qū)τ缘恼{(diào)控。一般認(rèn)為，雄性不育系的細(xì)胞質(zhì)中存在不育基因S，而核內(nèi)則有相對應(yīng)的一對或一對以上的隱性基因rfrf。而恢復(fù)系核中的恢復(fù)基因（restorer of fertility，Rf）能抑制CMS的表型，具有使不育恢復(fù)為可育的功能。以基因型表示為：不育系為 S（rfrf），保持系為 N（rfrf），恢復(fù)系為S（RfRf）或N（RfRf）。關(guān)于棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)機(jī)理已取得了一些初步的研究進(jìn)展。目前，主要通過圖位法或者差異分析法進(jìn)行研究。

圖位法即通過構(gòu)建遺傳圖譜和物理圖譜克隆恢復(fù)基因。2006年，Yin等［32］報道通過構(gòu)建與恢復(fù)基因連鎖的遺傳圖譜和物理圖譜，將恢復(fù)基因定位在第19號染色體上，物理定位于2個基因組BAC克隆100kb的重疊區(qū)域中。2008年，侯思宇［33］在（不育系 P30A×恢復(fù)系 Y18R）×保持系P30B回交群體中發(fā)現(xiàn)，子代育性分離比1∶1（不育∶可育），符合孟德爾遺傳規(guī)律，這表明育性恢復(fù)性狀是由一對顯性基因控制的；隨后以恢復(fù)系Y18R為材料構(gòu)建了與恢復(fù)基因連鎖的遺傳圖譜，在圖距總長為13．2 cM中，STS147標(biāo)記與恢復(fù)基因的遺傳距離為0．1 cM，同時發(fā)現(xiàn)了一個與恢復(fù)基因遺傳距離為2．4 cM的新標(biāo)記MGHES28。

以棉花三系為研究材料，也可以通過花發(fā)育基因的表達(dá)差異分析育性恢復(fù)機(jī)理。Zhang等［34］以棉花D8胞質(zhì)雄性不育系的雜合體（攜帶有恢復(fù)基因）和正常可育（不含有恢復(fù)基因）保持系的花藥組織為研究對象，使用差異顯示技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一些上調(diào)或者下調(diào)的基因，推斷它們與花藥發(fā)育相關(guān)，并指出恢復(fù)基因不是一個花粉特異表達(dá)的基因。

綜上所述，細(xì)胞質(zhì)雄性不育與恢復(fù)的機(jī)理可歸納為：①不育系線粒體的CMS基因改變了線粒體的一些代謝與能量狀態(tài)，包括呼吸鏈的改變；②恢復(fù)基因?qū)MS基因的功能具有抑制作用；③不育胞質(zhì)線粒體的狀態(tài)對其細(xì)胞核發(fā)出信號，使該不育胞質(zhì)的細(xì)胞核內(nèi)與雄蕊發(fā)育的相關(guān)基因表達(dá)異常，激活、抑制或進(jìn)入程序性死亡，在線粒體與細(xì)胞核內(nèi)參與信號傳遞作用的系統(tǒng)可能有活性氧、磷酸化、鈣等信號系統(tǒng)；而細(xì)胞核內(nèi)決定花器官形成的MADS?box轉(zhuǎn)錄因子或參與程序性死亡的蛋白質(zhì)則被認(rèn)為是CMS基因作用的靶蛋白［35］。

4 棉花雄性不育的應(yīng)用

4．1 核雄性不育系的培育方法與應(yīng)用

4．1．1 核雄性不育系的創(chuàng)造 棉花的核雄性系主要來源于自然突變體、人工轉(zhuǎn)育以及基因工程創(chuàng)造。如國內(nèi)的洞A，其原始不育系就是一株天然雄性不育株。靖深蓉等［36］利用人工轉(zhuǎn)育，將雙隱性核雄性不育系ms5ms6不育基因轉(zhuǎn)育到高產(chǎn)、耐黃萎病品種中棉所12，育成了同質(zhì)異核不育系和異質(zhì)同核不育系，改良了的雙隱性核不育系并保持了原ms5ms6的不育性穩(wěn)定而且徹底的特點(diǎn)，同時還去除了原雙隱性不育系的缺陷，如不抗風(fēng)暴等。

目前，利用植物基因工程和細(xì)胞工程的手段培育雄性不育系已逐漸成為主要的研究方法。Aarts等［37］從擬南芥中克隆了雄性不育基因，再通過遺傳工程法改造花藥絨氈層的遺傳組成，創(chuàng)造了棉花等農(nóng)作物的核雄性不育系。張慧軍等［38］利用TA29、A6、A9三個啟動子的功能區(qū)與Barnase基因融合構(gòu)建表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對棉花下胚軸進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了帶有Barnase不育基因的120株轉(zhuǎn)基因再生植株。同時利用基因工程技術(shù)在載體中加入了bxn基因，以賦予轉(zhuǎn)基因植株抗溴苯腈的能力，從而通過噴施溴苯腈殺死育性恢復(fù)植株，使不育材料得到保持。2010年，張玉芹等［39］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)T?DNA插入得到棉花雄性不育突變體，這為利用T?DNA標(biāo)簽法進(jìn)行雄性不育有關(guān)基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。

4．1．2 核雄性不育系的應(yīng)用 我國是以核雄性不育系“一系兩用法”利用棉花雜種優(yōu)勢較早、推廣面積較大的國家之一。目前，國內(nèi)已培育出洞A、川A、無62?1A等多個棉花核雄性不育系。其中，4個陸地棉核雄性不育系洞A、81A、1355A和閬A都是單基因隱性遺傳，而在核雄性不育系育成的雜交品種中，利用ms5ms6選育的品種有南農(nóng)98?4、中棉所38和印度的Suganan等，其他品種主要是利用ms14選育的。由于其他核不育本身存在顯性遺傳和部分不育等缺陷，不利于生產(chǎn)中應(yīng)用，因此目前常用的核雄性不育基因型主要為上述幾種。

國內(nèi)選育并且利用較早也較多的單隱性核雄性不育兩用系主要有洞A和芽黃81A。目前，利用洞A種質(zhì)已轉(zhuǎn)育成功751A、473A、83?IA、抗A1、抗A2、GA5和33A等衍生不育系，以及抗蟲兩用系抗A3和GA18等。利用洞A種質(zhì)轉(zhuǎn)育的兩用系先后選育出川雜一號、川雜四號、川雜六號、魯棉八號等高優(yōu)勢組合。除此之外，現(xiàn)在已培育了核雄性不育雜種棉組合幾十個，到20世紀(jì)90年代末，核不育系在雜交棉上得到了大面積應(yīng)用。

與此同時，國內(nèi)外對雙隱性核不育也進(jìn)行了研究與應(yīng)用。其中，我國利用新雙隱性核不育系與自主構(gòu)建和轉(zhuǎn)育的Bt抗蟲基因品系雜交選育出了抗蟲雜交棉中抗雜A（中棉所38號），是國內(nèi)首個通過國家審定的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲雜交棉。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)利用msc5msc6雙隱性核不育基因培育出了南農(nóng)6號［40］、南農(nóng)9號［41］和98?4［42］等抗蟲核不育雜交品種。

4．1．3 標(biāo)記核不育系的研究 標(biāo)記核不育系是通過指示性狀在苗期就可分辨出不育株和可育株，可提高制種效率，更有利于生產(chǎn)中的應(yīng)用。81A（ms16）就是帶芽黃標(biāo)記性狀的單隱性核不育系［43］。

4．2 胞質(zhì)雄性不育系的培育與應(yīng)用

20世紀(jì)60年代，Meyer等［3］育成了具有哈克尼西棉胞質(zhì)（G．harknessii Brandegee）的 DES?HAMS277和DES?HAMS16不育系（D2-2）及其保持系和恢復(fù)系，實(shí)現(xiàn)了三系配套。90年代，Stewart等［5］育成了具有三裂棉細(xì)胞質(zhì)的不育系（D8ms）及相應(yīng)保持系和恢復(fù)系（D8mf）。國內(nèi)湖南省棉花所于1979年通過海島棉×陸地棉×瑟伯氏棉（G．thurberi Tod）雜交，選育出海島棉胞質(zhì)雄性不育系湘遠(yuǎn)A。賈占昌等［7，8］以陸地棉（石短5號）為母本，海島棉（軍海棉）為父本，經(jīng)多代雜交，選育出具有陸地棉（AD1）胞質(zhì)的新型不育系104?7A。1996年，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)和山西農(nóng)科院通過種間復(fù)式雜交的方法，從（陸地棉×瑟伯氏棉）×（亞洲棉×陸地棉）的雜交后代中選育出新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，名為晉A胞質(zhì)雄性不育系，它具有二倍體亞洲棉和野生棉的遺傳背景［6］。2000年，李蒙恩等［44］以哈克尼西棉胞質(zhì)不育系DES?HAMS277育成了中A和PA等4個優(yōu)良的不育系。

根據(jù)現(xiàn)有報道，目前已有哈克尼西棉、三裂棉、異常棉、亞洲棉和陸地棉胞質(zhì)雄性不育系，其中只有哈克尼西棉、三裂棉和陸地棉的不育系實(shí)現(xiàn)了三系配套。

目前國內(nèi)也已培育出多個優(yōu)良的恢復(fù)系。王學(xué)德［45］將一個具有抗逆性能的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S?transferase，GST）基因?qū)牖謴?fù)系DES?HAF277中，培育出“浙大強(qiáng)恢”。與DES?HAF277相比，“浙大強(qiáng)恢”對不育系的恢復(fù)力提高了25．8%，從而使雜種F1單株結(jié)鈴數(shù)平均多3．6個，不孕籽率降低了 10．l%，皮棉產(chǎn)量提高了10．6%。華金平等［46］采用遠(yuǎn)緣雜交的手段，利用來源于異常棉的恢復(fù)基因，育成了陸地棉×異常棉雜種后代恢復(fù)系，該恢復(fù)源自身育性好，花粉充足，而且可完全恢復(fù)哈克尼西棉胞質(zhì)不育系的育性。2005年，采用基因工程技術(shù)培育的“銀棉2號”［47］，是我國第一個國家審定的三系雜交抗蟲棉新品種，它在生產(chǎn)上不但解決了棉鈴蟲的危害，而且比常規(guī)抗蟲棉增產(chǎn)26．4%。該品種突破了以往三系雜交棉無產(chǎn)量優(yōu)勢或產(chǎn)量優(yōu)勢不明顯的瓶頸，在技術(shù)上處于國際領(lǐng)先水平，同時使棉花產(chǎn)量大幅度提高?！般y棉2號”的母本為不育率和不育度均達(dá)100%的棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A，其遺傳起源為我國研制的陸地棉胞質(zhì)不育系104?7A，；恢復(fù)系Y18R遺傳起源于引入恢復(fù)系0?613?2R，并聚合了我國陸地棉的品種中的恢復(fù)加強(qiáng)基因，其雜種一代的恢復(fù)度達(dá)到100%。2008年，轉(zhuǎn)抗蟲基因中熟三系雜交品種“銀棉8號”又取得農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)應(yīng)用安全證書（轉(zhuǎn)基因生物名稱為SGKz34?3），符合國家棉花品種審定標(biāo)準(zhǔn)，通過審定。

5 存在的問題及解決方法

5．1 有關(guān)棉花雄性不育的分子機(jī)理研究滯后

有關(guān)棉花雄性不育的分子機(jī)理，尤其是胞質(zhì)不育的機(jī)理，尚缺乏足夠的分子生物學(xué)證據(jù)。目前對哈克尼西棉胞質(zhì)、三裂棉胞質(zhì)和陸地棉胞質(zhì)的雄性不育的機(jī)理有一定的了解，但還不夠深入，而對于海島棉胞質(zhì)的雄性不育得機(jī)理則知之甚少。一方面，雄性不育的機(jī)理，尤其是胞質(zhì)不育，可能情況較為復(fù)雜；另一方面，棉花基因組很大，從分子水平上研究也存在很多困難，這兩方面導(dǎo)致胞質(zhì)不育的分子生物學(xué)研究滯后。隨著新的研究技術(shù)和方法的不斷出現(xiàn)，這為加快研究提供了條件。比如，針對棉花基因組較大的特點(diǎn)，可以構(gòu)建BAC文庫或TAC文庫，再利用分子標(biāo)簽篩選目的基因。

5．2 現(xiàn)有雄性不育系在生產(chǎn)應(yīng)用上存在的缺陷

生產(chǎn)中應(yīng)用的不育系主要有核不育系和胞質(zhì)不育系兩種類型，但都存在一定缺陷。核雄性不育系主要是育性不夠穩(wěn)定，而且保持不育難，生產(chǎn)上能夠應(yīng)用的品種較少；同時，雖然可以一系兩用，但必須拔除一半的可育株，這會影響雜交種制種產(chǎn)量。對于細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，由于其胞質(zhì)含有產(chǎn)量不利因子，因而育性較難恢復(fù)，恢復(fù)源狹窄，而且雜種優(yōu)勢不夠強(qiáng)。

對于目前雄性不育存在的缺點(diǎn)，可通過以下方法解決：鑒于現(xiàn)有核不育的育性不穩(wěn)定的現(xiàn)象，可運(yùn)用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)，將構(gòu)建的嵌合基因轉(zhuǎn)化植株，培育新的雄性不育材料。例如，用花粉特異啟動子驅(qū)動細(xì)胞毒素基因表達(dá)，細(xì)胞毒素能選擇性地破壞與花藥發(fā)育相關(guān)的器官或組織，從而獲得不育材料；還可以通過RNA干擾技術(shù)阻斷與花粉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)以獲得雄性不育材料。對于胞質(zhì)不育，細(xì)胞質(zhì)對雜種F1代的產(chǎn)量和早熟性等性狀造成的影響，以及恢復(fù)源狹窄和恢復(fù)力弱的缺點(diǎn)，可以運(yùn)用基因工程手段和傳統(tǒng)育種互補(bǔ)的方法，轉(zhuǎn)入有益基因或遠(yuǎn)緣雜交來豐富親本的種質(zhì)基礎(chǔ)，增強(qiáng)高產(chǎn)、抗病、抗蟲耐鹽堿等特性，同時選育優(yōu)良的不育系和恢復(fù)系，來提高恢復(fù)系的恢復(fù)力，如恢復(fù)系Y18，對26A來源的所有不育系可100%恢復(fù)。

6 展望

棉花雄性不育在生產(chǎn)上有很多優(yōu)勢，如用工少，制種成本低，制種效率高等，而且雜種一代可以復(fù)合抗病、高產(chǎn)等多個優(yōu)良品質(zhì)于一體，因而棉花雄性不育系在生產(chǎn)上有著很高的應(yīng)用價值。同時，由于雄性不育的分子機(jī)理對培育棉花新品種和改良棉花品質(zhì)都具有重要的意義，因此對于雄性不育分子機(jī)理的研究已成為一個熱點(diǎn)。

在對雄性不育系的研究方面，突破點(diǎn)是弄清雄性不育的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，研究其不育機(jī)理和選育利用工作。目前，克隆不育基因或恢復(fù)基因多從基因組水平加以研究，今后還可以嘗試從轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平入手。同時在不育系育種方面，通過利用現(xiàn)有不育系的基礎(chǔ)上，努力創(chuàng)造更加優(yōu)良的不育系類型。

缺乏強(qiáng)優(yōu)勢組合是制約棉花雜種優(yōu)勢利用的重要因素。解決這一問題的主要途徑有：①篩選強(qiáng)優(yōu)勢組合親本。今后要加強(qiáng)向優(yōu)良親本材料轉(zhuǎn)育抗病、抗蟲、高強(qiáng)纖維、耐旱堿等性狀，以培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和高抗的特色品種；②利用雄性不育系雜交制種；③在技術(shù)上可選擇常規(guī)品種選育與雜種優(yōu)勢利用相結(jié)合的方法，同時，利用現(xiàn)代先進(jìn)的育種手段加速對優(yōu)良品種培育的進(jìn)程。

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Advanced Study on the M ale Sterility of Cotton

SHIYa?li，ZHANG Rui，MENG Zhi?gang，ZHOU Tao，SUN Guo?qing，MENG Zhao?hong，GUO San?dui?
Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China

There is fully apparent heterosis in cotton，showing on the production，quality and physiological characteristics of cotton．Themale sterility on cotton has played an important role in heterosis usage in cotton．Utilization of themale sterile system havemade a breakthrough in conquering breeding bottleneck by artificial emasculation and unfolded a brightoutlook for promoting commercial production ofhybrid seed．This paper reviewed themajor advances ofbiological research on themale sterility in cotton in the past decade；focused on the types，cytological features，mechanisms and breedingmethod ofmale sterile cotton；analyzed the existed problems；and maked prospects ofmale sterility applications．

cotton；male sterility；heterosis

10．3969／j．issn．2095?2341．2013．05．04

2013?07?25；接受日期：2013?09?10

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2008ZX08005?004）資助。

石雅麗，博士，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ?。E?mail：shiyali2006＠126．com。?通信作者：郭三堆，研究員，從事棉花基因工程研究。E?mail：guosandui＠caas．cn