雷旻

紅細(xì)胞Duffy血型是人類血型系統(tǒng)中重要的血型系統(tǒng)之一，且與臨床多種疾病相關(guān)，它在人群中的分布因種族不同而有較大的變化，Duffy血型系統(tǒng)的抗體可造成遲緩性、致命性的溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血?。?-3］。筆者通過建立Duffy血型PCR-SSP基因分型方法，結(jié)合血型血清學(xué)方法，研究深圳地區(qū)人群Duffy血型基因的分子遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)和多態(tài)性，為Duffy血型于HDN產(chǎn)前檢查的可行性研究提供理論依據(jù)，報(bào)告如下。

1 材料及方法

1.1 樣品 采用我院收集的孕婦及其丈夫的血液樣品共104例新鮮血樣，羊水1例(細(xì)胞DNA采用常規(guī)酚/氯仿法提取)。采取血清學(xué)方法檢測Duffy血型的表現(xiàn)型。提取基因組DNA選用 PEL-FREEZ DNA 提取試劑盒(Lo：t038，Batch：27268)，A260/280均在 1.6 ～1.8。稀釋到 65 ng/μl，于 -40℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑 主要包括低溫冰箱，控溫高速離心機(jī)，紫外光測定儀，電泳儀，PCR擴(kuò)增儀，凝膠成像儀等設(shè)備。Duffy血型分型試劑(Lo：t#RB01)由美國Singma公司提供，內(nèi)有Fya和Fyb混合引物，TD buffer，內(nèi)對照。Taq酶由Promega公司提供(Lo：t 20198221)。

1.3 方法

1.3.1 采用經(jīng)典的血型血清學(xué)技術(shù)，包括鹽水介質(zhì)法、酶法、抗球蛋白介質(zhì)試驗(yàn)等方法鑒定Duffy血型。

1.3.2 血型分子生物學(xué)方法：①在采集的EDTA抗凝血液中抽取基因組DNA。②以Genbank數(shù)據(jù)庫查找相關(guān)血型標(biāo)準(zhǔn)基因序列，找出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)，靈活運(yùn)用Primer 3.0軟件，合成的引物序列為：A：5-CACTGCATCTGACTCCTGCAGA-3，以PCR-SSP(序列特異性引物)法直接鑒定血型基因的多態(tài)性。

1.4 基因頻率計(jì)算 依據(jù)MourantAE方法。

2 結(jié)果

2.1 血液樣品的Duffy基因型 Fya基因個(gè)體和Fy-a分型混合液反應(yīng)，能夠產(chǎn)生711 bp擴(kuò)增片段。Fyb基因個(gè)體和Fy-b分型混合液反應(yīng)，能夠產(chǎn)生711bp擴(kuò)增片段。Fyab基因個(gè)體，分別和兩種分型混合液反應(yīng)能夠產(chǎn)生711 bp擴(kuò)增片段。Fy(a-b-)個(gè)體，分別和兩種分型混合液反應(yīng)，不會(huì)產(chǎn)生特異性的PCR擴(kuò)增片段，只產(chǎn)生429 bp內(nèi)對照產(chǎn)物。見表1。

2.2 羊水Duffy血型的基因定型 用PCR-SSP 方法檢測孕婦的羊水樣品1例，檢測出孕婦為Fy(a-b+)型，丈夫?yàn)镕y(a+b-)型。

3 討論

Duffy血型系統(tǒng)作為人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)之一，是由Cutbush等在1950年經(jīng)過多次輸血而引起溶血的患者血清中發(fā)現(xiàn)一種抗體，稱將其稱為抗-Fya，因?yàn)榛颊咝誅uffy，故稱Duffy血型［4］。近年來隨診醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，Duffy血型系統(tǒng)的研究取得較大的進(jìn)展。Duffy血型抗原在自身免疫性疾病、新生兒溶血病、炎癥、移植排斥反應(yīng)、腫瘤等方面均有著重要的作用，其在臨床疾病發(fā)生發(fā)展過程中作用以及意義正逐漸被人們所知，但具體變化機(jī)制仍不十分清楚，尚有很多問題仍需進(jìn)一步探討。這些問題的深入研究，將會(huì)在疾病的防治方面獲得創(chuàng)新性的成果以及實(shí)效［5］。Duffy血型基因位于人類染色體的1q21～q25。一些Duffy血型的抗體可能是由于懷孕的刺激而產(chǎn)生的，但大多數(shù)是由于輸血而引起［6］。Fya抗體的產(chǎn)生常常伴隨產(chǎn)生其他的抗體。由于Fya的免疫原性中等，因此抗-Fya可以引起輕微的即發(fā)型或遲發(fā)型溶血性反應(yīng)，但一些急性反應(yīng)仍可能是致命的［7］。Fya和Fyb抗原胎兒出生時(shí)已發(fā)育完全，并在懷孕初期6～7周即可檢測到該抗原。Duffy抗原是由不同亞單位組成的糖蛋白，Duffy糖蛋白在非紅系的組織上照樣存在。用血清學(xué)方法可以將Duffy血型分為4種常見表現(xiàn)型：Fy(a+b-)、Fy(a+b+)、Fy(a-b+)和 Fy(a-b-)。本研究內(nèi)容通過了解中國人群中Fya、Fyb和Fy等位基因中核酸的變化，設(shè)計(jì)出基于PCR的技術(shù)，有助于診斷Duffy的基因型并預(yù)判其表型，建立DNA序列分析方法。本研究結(jié)果表明，用上述PCR-SSP法，所有血液樣品均可正確判型。

綜上所述，應(yīng)用PCR-SSP方法能夠準(zhǔn)確檢測血液和羊水樣品的Duffy基因型，能夠用于Duffy血型不合引起的新生兒溶血反應(yīng)的產(chǎn)前診斷。

1 許劍鋒，劉衍春，吳敏慧.PCR-SSP法檢測Rh陰性無償獻(xiàn)血者Duffy血型的基因分型研究.現(xiàn)代診斷與治療，2007，18：336-337.

2 張雄民，王晨，劉曦，等.上海地區(qū)稀有血型Duffy系統(tǒng)Fy～a陰性獻(xiàn)血者篩查和臨床應(yīng)用.中國輸血雜志，2010，23：293-294.

3 Parasol N，Cohen N，Zemishilany Z，et al.Duffyan tigen/R eceptor for chemokines(DARC)：Genotypesin Ashkenazi and Non-Ashkenazi Jews in Isreal.HumBiol，2001，73：307-313.

4 李劍平，劉顯智，巖本貞彥，等.Duffy血型基因定型及其用于HDN產(chǎn)前診斷的探討.中國輸血雜志，2003，16：1-3.

5 張獻(xiàn)清，馬建崗，吳道澄.Duffy血型系統(tǒng)的分子遺傳學(xué)及其臨床應(yīng)用.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，21：30-32.

6 查占山，錢寶華.Duffy血型抗原的生物學(xué)功能及臨床研究進(jìn)展.臨床輸血與檢驗(yàn)，2006，8：67-70.

7 Christina LA，John AB，M arie DB，et al.O verexpression of the duffy antigen/receptor for chemokine(DARC)by NSCLL tumor cells resu lts in increased tumor necrosis.Bmc Cancer，2004，23：28.