曾曉娟 馬福家 司曉莉

（中國人民解放軍第455醫(yī)院藥劑科 上海 200052）

小兒化毒散收載于《中華人民共和國藥典》（2010年版I部），由大黃、冰片、人工牛黃、黃連、天花粉、珍珠、赤芍和川貝母等12味藥組成，具有清熱解毒、活血消腫的功效，用于小兒熱毒內(nèi)蘊、毒邪未盡之口瘡腫痛，煩躁口渴，大便秘結(jié)等癥[1]。其中人工牛黃含有效成份膽紅素，其質(zhì)量標準中未收載檢測方法。為能更好地控制本制劑質(zhì)量，本文采用比色法對膽紅素進行含量測定[2-3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計（美國Varian公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；電熱恒溫水浴鍋（江蘇南通縣通海電器廠）等。

1.2 試劑

膽紅素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號10077-0101），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。小兒化毒散（廣西南珠制藥有限公司，0.6 g/瓶，批號：20110402）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取膽紅素對照品10 mg至100 ml棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml至50 ml棕色量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，精密稱取15 g裝量的樣品，置圓底燒瓶中，加三氯甲烷-乙醇（7：3）混合溶液60 ml、鹽酸1滴，搖勻，置水浴65 ℃中加熱回流30 min，放冷，過濾，置100 ml棕色量瓶中。容器用少量混合溶液洗滌，洗液并入同一量瓶中，加上述混合溶液至刻度，搖勻。精密量取上清液10 ml，置50 ml棕色量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定波長的選擇

精密量取膽紅素對照品2 ml，置具塞試管中，加乙醇至9 ml，精密加入重氮化溶液（甲液：取對氨基苯磺酸0.1 g，加鹽酸1.5 ml與蒸餾水適量使成100 ml。乙液：取亞硝酸鈉0.5 g，用蒸餾水溶解并稀釋至100 ml，置冰箱內(nèi)保存。臨用時取甲液10 ml、乙液0.3 ml混勻）1 ml，搖勻，在15 ℃暗處放1 h，以相應的試劑為空白，掃描，在400～800 nm波長范圍內(nèi)測定吸收光譜。結(jié)果膽紅素對照品溶液在533 nm波長處有最大吸收峰，故以533 nm為測定波長。

2.4 標準曲線的繪制

精密量取“2.1”項下對照品溶液1、2、3、4、5 ml，置試管中，分別加乙醇至9 ml， 按“2.3”項下自“精密加入重氮化溶液”起依法操作，相應試劑做空白，在533 nm波長處測定吸光度 ，以吸光度為縱坐標， 濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：Y=6.441X+0.006 7，r= 0.999 8。膽紅素在0.010 3～0.050 0 mg/ml范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取膽紅素對照品溶液，按上述方法重復測定6次，測得吸光度分別為：0.124 2、0.124 9、0.123 8、0.124 7、0.124 1和0.123 5 OD，平均值為0.124 2 OD，吸光度的RSD為0.42%。 結(jié)果表明，本方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取膽紅素對照品溶液，分別于配制后0、3、6、9 h，按上述方法測定吸光度，結(jié)果表明對照品溶液在9 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗

分別精密吸取膽紅素標準液5 ml 6份，按“2.4”項下操作，測得吸光度分別為：0.328 1、0.328 5、0.328 9、0.327 9、0.327 7和0.327 4 OD，平均值為0.124 2 OD，吸光度的RSD為0.17%。結(jié)果表明，此方法有較好的重現(xiàn)性。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取樣品細粉約1瓶總量，精密加入膽紅素對照品0.05 mg，置圓底燒瓶中，按“2.2”項下方法制備溶液6份，在533 nm波長處測定其吸光度，計算膽紅素平均回收率為99.36%，RSD為0.45% （n=6），結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定

取小兒化毒散3批，每批1瓶樣品，按“2.2”項下方法平行制備3份供試品溶液，根據(jù)測得的吸光度和標準曲線，測定含量，結(jié)果見表2。

3 討論

按方法同時制備空白樣品溶液，在400～800 nm的波長范圍內(nèi)掃描，無吸收，不干擾膽紅素的含量測定，故選擇533 nm波長作為膽紅素含量測定的檢測波長是合理的。

小兒化毒散的原標準中無人工牛黃的含量測定，不能完整地控制該品種的質(zhì)量。本實驗采用藥典方法比色法測定膽紅素的含量，經(jīng)多次測定，小兒化毒散中膽紅素的含量限度為不低于41.4 μg/瓶。通過上述方法學考察，建立了小兒化毒散中膽紅素的含量測定方法，該方法簡便快捷，結(jié)果準確，重現(xiàn)性、回收率好，能有效控制小兒化毒散中人工牛黃的質(zhì)量。

表2 小兒化毒散每瓶中膽紅素的含量

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版（一部）[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 478.

[2]孫新建, 李志浩, 吳進, 等. RP-HPLC測定小兒化毒散中大黃素和大黃酚的含量[J]. 中醫(yī)藥導報, 2010, 16(10): 93-95.

[3]羅曉茹, 曹紅, 邢俊波, 等. 人工牛黃及其制劑中膽酸含量測定的研究進展[J]. 解放軍藥學學報, 2009, 25(3): 247-249.