李 宏 付冠艷 付淑君 鐘菲菲

劉 佩2 曾 林2 楊麗霞2

（1.中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可中心，北京 100062；2.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)報(bào)告［1］表明，食源性疾病的實(shí)際發(fā)病數(shù)要比報(bào)告的病例數(shù)多300～500倍，全世界因食物污染而致病者已達(dá)數(shù)億。發(fā)展中國(guó)家常見的食源性疾病包括霍亂、大腸桿菌感染、沙門氏菌病、志賀氏菌病等。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心資料［2，3］顯示，近10年來，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別占17.9%，8.9%，5.6%，是最常見和最主要的病因物質(zhì)。2000～2005年湖南省共發(fā)生食物中毒325起，中毒8 998人，死亡85人。中毒場(chǎng)所以家庭發(fā)生最多，占總中毒起數(shù)的45%，中毒人數(shù)以集體食堂最多，中毒原因中以化學(xué)性和生物性食物中毒發(fā)生起數(shù)最高，占總發(fā)生起數(shù)的45%［4］。因此，建立一種便捷、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于避免食源性致病菌污染，降低中毒事件的發(fā)生率具有重要意義。

目前食源性致病菌的檢測(cè)仍以傳統(tǒng)方法為主，細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化鑒定耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、環(huán)境及主觀因素影響較 大［5］；生 化 鑒 定 法［6］和 PCR 法［7，8］等 不 僅 需 要 昂 貴 的 設(shè)備，還需要較高的技術(shù)要求和資金投入，制約了在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中的應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)是在20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的，具有簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)［9－11］，可在基層單位進(jìn)行各種食源性致病菌的快速篩查。膠體金免疫試紙條作為一種簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)技術(shù)，無需洗滌，不需要貴重儀器設(shè)備，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、可單份測(cè)定，全過程只需15min左右，結(jié)果易于判斷，成為目前生物快速檢測(cè)的主要方法之一。

1 膠體金免疫層析技術(shù)

1.1 膠體金免疫層析原理

膠體金免疫層析技術(shù)將金標(biāo)技術(shù)、免疫技術(shù)和層析技術(shù)相結(jié)合，是一種固相標(biāo)記免疫技術(shù)［12］。其原理是在硝酸纖維素膜的某一區(qū)段固定特異性抗體，把該硝酸纖維素膜一端浸入樣品溶液后，由于毛細(xì)管作用，樣品將向該膜的另一端移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到固定有抗體的區(qū)段時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體特異性結(jié)合，該區(qū)域便呈現(xiàn)一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性免疫檢驗(yàn)［13］，該法通常有雙抗體夾心和競(jìng)爭(zhēng)法兩種形式。

1.2 操作步驟

1.2.1 膠體金的制備 膠體金又稱金溶膠，是金鹽被還原成金后形成的金顆粒懸液，它具有一般溶膠的特性［14］。膠體金溶液的制備方法有化學(xué)還原法、電化學(xué)還原法、高分子保護(hù)法、反膠團(tuán)法等［15］，最經(jīng)典的還是1973年Frens建立的檸檬酸還原法［16］，目前該法仍然是制備納米金的首選［17］。

1.2.2 膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì) 膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)反應(yīng)的機(jī)制至今仍無確切結(jié)論。一般認(rèn)為：由于膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)表面帶正電荷，二者通過靜電作用相結(jié)合［18］。也有人提出不同的觀點(diǎn)，Oliver［19］認(rèn)為膠體金不僅展示了靜電荷特性，同時(shí)也展示了疏水特性，膠體金粒子的表面存在帶負(fù)電荷的疏水性基團(tuán)，可與待標(biāo)記蛋白通過疏水相互作用結(jié)合。標(biāo)記前用K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH值［20］至略大于蛋白等電點(diǎn)［21］0.5個(gè)pH 單位，這時(shí)蛋白質(zhì)呈電中性［22］，不會(huì)因?yàn)殪o電引力而聚集。膠體金標(biāo)記蛋白最重要的是選擇合適的pH值和抗體（抗原）的用量，沉淀用含少量穩(wěn)定劑的溶液懸?。?3］即可。

1.2.3 膠體金試紙條的制備 膠體金試紙條一般由樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水墊四部分組成。層析材料有硝化纖維膜（NC）、聚酯膜、尼龍膜和PVDF膜等［24］，根據(jù)試驗(yàn)需要可選擇不同要求的膜，其中NC膜最為常用，使用前可根據(jù)試驗(yàn)具體情況確定是否需要活化或處理，多數(shù)情況下無需處理，即可直接使用。周文達(dá)等［25］通過化學(xué)法證明活化后的NC膜可大大提高檢測(cè)穩(wěn)定性和靈敏度。

將金標(biāo)蛋白溶液均勻噴涂在金標(biāo)墊上，于室溫下晾干備用。NC膜可捕獲一定量的包被抗原（抗體）和二抗作為檢測(cè)線和質(zhì)控線。最后將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙依次固定于PVC板，即成試紙條［26］。試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，密封保存。密封的測(cè)試條室溫下一般可保存6～18個(gè)月。

2 在食源性致病菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 沙門氏菌的檢測(cè)

沙門氏菌是食源性疾病中最常見的病原菌，2003～2005年中國(guó)食源性疾病中沙門氏菌占微生物的17.2%，排在第2位［27］。美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心數(shù)據(jù)顯示：在1997年大約有30萬個(gè)腸炎沙門氏菌感染引起的病例，傳染源多為雞蛋［28］。Seo等［28］用免疫層析試紙條檢測(cè)純培養(yǎng)和雞蛋中的沙門氏菌，得到最低檢測(cè)限分別為1×107，1×108CFU／mL；陳瓊等［29］用自制的沙門氏菌膠體金試紙條最低可檢測(cè)2.3×105CFU／mL。

2.2 大腸桿菌O157的檢測(cè)

在食源性病原微生物中，腸出血性大腸桿菌占有重要地位，其主要包括 O157：H7、O26：H11和 O111，O157：H7是出血性腸炎的主要致病菌［30－32］。1982年，O157：H7在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地散發(fā)或地方流行。1996年在日本大阪地區(qū)發(fā)生O157：H7流行，患者逾萬，死亡11人。2001年在中國(guó)江蘇、安徽等地發(fā)生了多次食源性感染O157：H7事件，導(dǎo)致177人死亡［13］。王靜等［33］用膠體金法檢測(cè)奶粉、面粉、淀粉等樣品中的大腸桿菌O157，得到最低檢測(cè)限為1×105CFU／mL；黃嶺芳等［34］用此法檢測(cè)牛肉、萵苣等樣品中的大腸桿菌O157，得到最低檢測(cè)限為1×104CFU／mL。

2.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌能引起人畜共患疾病，它是某些食物（主要是鮮奶產(chǎn)品）中的一種污染物，能引起敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多，導(dǎo)致嚴(yán)重食物中毒，病死率高達(dá)30%～70%［35］。崔煥忠等［36］利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)致病性李斯特菌特異性蛋白－肌動(dòng)蛋白聚合蛋白（actin polymerizing protein，ActA），制備單增李斯特菌特異性抗體，研制出該菌的膠體金檢測(cè)試紙，蔬菜、牛奶中的最低檢出限為3.9×105CFU／mL。

2.4 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

金黃色葡萄球菌在空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到，因而食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性難題，在美國(guó)由其引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，在加拿大則占到45%［37］。目前，在金黃色葡萄球菌診斷方面，Hoover等［38］利用生化方法準(zhǔn)確地鑒定出此菌；Rall等［39］利用PCR法進(jìn)一步找出了其腸毒素基因，這些方法雖然精確、敏感，但需要精密儀器設(shè)備，費(fèi)時(shí)且成本高，目前難以在基層單位推廣應(yīng)用，膠體金檢測(cè)法讓這些難題有了解決的方向。劉洪貴等［40］通過自制多克隆抗體，制備免疫膠體金來檢測(cè)牛奶中的金黃色葡萄球菌，靈敏度可達(dá)1×104CFU／mL；Su－Hua Huang等［41］利用金黃色葡萄球菌的一種代謝產(chǎn)物是蛋白A的特性，通過在納米金表面標(biāo)記抗蛋白A的IgG制備試紙條，檢測(cè)豬肉、牛肉中的金黃色葡萄球菌，靈敏度高達(dá)25CFU／g。

2.5 豬鏈球菌的檢測(cè)

豬鏈球菌是革蘭氏陽性菌，在自然界中分布廣泛，可引起豬的敗血性和局灶性淋巴結(jié)化膿性病癥，能通過受傷的皮膚和黏膜感染人［42，43］，引起人的腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎，極少數(shù)可以造成永久性失聰［44－46］。Ying Ju等［47］通過自制抗豬鏈球菌的多克隆抗體來制備膠體金試紙條，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1×106CFU／mL。

3 展望

目前，膠體金免疫試紙條在食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域還沒有中國(guó)國(guó)產(chǎn)成型的產(chǎn)品，仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度、實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)是未來發(fā)展的方向。由于致病菌種類繁多，同種致病菌又存在多個(gè)亞種，這使得如何獲得高特異性抗體成為膠體金免疫試紙法成功的關(guān)鍵和難點(diǎn)，探索致病菌在體內(nèi)的受體可為高特異性抗體的獲得提供研究方向。

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