張野妹，潘志娟，2

(1.蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇蘇州215021;2.現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州215123)

天然絲包括蠶絲、蜘蛛絲等，由于其優(yōu)異的力學(xué)性能再加上良好的生物相容性和生物可降解性而受到了廣泛的關(guān)注，尤其是在生物醫(yī)用領(lǐng)域，包括組織工程支架、藥物釋放等方面具有很好的應(yīng)用前景。但是通過(guò)天然絲再生得到的絲蛋白材料的性能，特別是力學(xué)性能，卻與天然絲存在較大差距，并因此制約了再生絲蛋白材料的應(yīng)用。

材料的性能取決于結(jié)構(gòu)，對(duì)材料結(jié)構(gòu)的深入探究對(duì)提高其性能具有至關(guān)重要的作用。二級(jí)結(jié)構(gòu)(分子構(gòu)象)是決定再生天然絲蛋白材料性能的主要因素之一，除了蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，如氨基酸片段的排列，絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)還受許多因素的影響，如成絲過(guò)程［1］、pH 值、溫度、金屬離子、溶劑、絲蛋白濃度等。近年來(lái)，研究人員采用各種測(cè)試技術(shù)對(duì)再生天然絲蛋白材料制備過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變進(jìn)行了探討。用紅外光譜(FTIR)和拉曼光譜分析不同構(gòu)象絲蛋白的酰胺譜帶在光譜中的吸收位置;X-射線衍射光譜(XRD)是對(duì)β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定;圓二色光譜(CD)是利用蛋白質(zhì)作為光學(xué)活性物質(zhì)，絲蛋白分子在不同波長(zhǎng)光下具有圓二色性，即光通過(guò)時(shí)對(duì)左右旋圓偏振光吸收率的差異，進(jìn)行構(gòu)象的定性或定量分析;核磁共振光譜(NMR)是利用丙氨酸殘基中Cβ的化學(xué)位移對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象變化的靈敏度，以及在10×10-6～30×10-6(10～30 ppm)范圍內(nèi)對(duì)其去卷積可以得到絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的成分信息［2］。隨著科技的發(fā)展，電子順磁共振光譜(EPR)、熒光光譜等越來(lái)越多的測(cè)試技術(shù)被用來(lái)進(jìn)行絲蛋白分子構(gòu)象含量的測(cè)定和轉(zhuǎn)變機(jī)理的研究。

筆者主要對(duì)近年來(lái)關(guān)于再生天然絲蛋白(主要是桑蠶絲素蛋白，下文中簡(jiǎn)稱絲素蛋白)溶液或膜，在不同條件下分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變特征及機(jī)理進(jìn)行綜述分析，以更好地了解絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系，從而為制備高性能的再生天然絲蛋白材料提供理論基礎(chǔ)。

1 溶劑對(duì)天然絲蛋白分子構(gòu)象的影響

1.1 醇類溶劑的作用

Jin Nam等［3］研究了醇的類型和濃度對(duì)再生絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響。用CD測(cè)定了加入甲醇、乙醇、丁醇、辛醇等不同類型的醇溶劑后，再生絲素蛋白溶液的構(gòu)象變化。結(jié)合XRD測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入甲醇和乙醇后，譜圖上都清晰地出現(xiàn)了β-折疊構(gòu)象的特征，但辛醇處理則沒(méi)有出現(xiàn)β-折疊而是保持了無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象;丁醇作用后，譜圖特征則顯示出β-折疊、無(wú)規(guī)線團(tuán)和α-螺旋的混合構(gòu)象。FTIR的測(cè)定結(jié)果反映了甲醇濃度的作用為:體積分?jǐn)?shù)在5%以下時(shí)，絲蛋白溶液主要呈現(xiàn)為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，大于15%時(shí)出現(xiàn)明顯的β-折疊構(gòu)象，并且強(qiáng)度隨濃度增加而增強(qiáng)。進(jìn)一步用XRD測(cè)定與分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于15%時(shí)，構(gòu)象從無(wú)規(guī)向β-折疊轉(zhuǎn)變，與FTIR的結(jié)果一致，并且濃度增加后絲素蛋白的結(jié)晶度也增大。

陳新等［4-5］運(yùn)用時(shí)間分辨紅外光譜研究再生絲素蛋白膜和溶液經(jīng)不同濃度醇處理后分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于絲素膜，通過(guò)膜的溶脹而使絲蛋白分子鏈獲得可以運(yùn)動(dòng)的自由空間進(jìn)而發(fā)生氫鍵重組是構(gòu)象轉(zhuǎn)變的前提，醇分子的大小、濃度(水含量)均對(duì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變有顯著影響。由于甲醇分子體積較小可以擴(kuò)散到膜中使其溶脹，絲蛋白膜在純甲醇中可以發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，但是在純乙醇和純異丙醇中卻幾乎不能發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變;當(dāng)醇濃度太高時(shí)，由于水太少膜得不到充分的膨脹而無(wú)法進(jìn)行構(gòu)象的轉(zhuǎn)變;當(dāng)乙醇和異丙醇溶液中水的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到7% ～8%時(shí)，由于有足夠的水使膜溶脹，絲蛋白開(kāi)始發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變。絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變速率隨醇溶液中水含量的增加而增大，當(dāng)水的含量足夠多時(shí)，絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變速率不再受膜溶脹速率控制而是受醇濃度的影響，但是當(dāng)醇濃度太低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致膜的溶解。溶液中由于蛋白分子鏈能夠更自由更完全地移動(dòng)，所以構(gòu)象轉(zhuǎn)變更顯著，并且膜和溶液中蛋白分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變都經(jīng)歷了三個(gè)階段:1)成核階段，這一階段只有在醇濃度較低時(shí)才能看到，速度較慢且速度取決于醇濃度，同時(shí)絲蛋白濃度的降低也會(huì)使β-折疊結(jié)構(gòu)的形成減慢;2)β-折疊結(jié)構(gòu)快速形成階段;3)β-折疊結(jié)構(gòu)完善階段，速度較慢。

Zhonghou Zheng等［6］用硫氰酸鋰溶液溶解柞蠶絲絲素，經(jīng)過(guò)透析后得到柞蠶絲素蛋白水溶液，用圓二色光譜測(cè)得絲蛋白水溶液的分子構(gòu)象主要為α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。將絲蛋白水溶液常溫風(fēng)干后得到絲蛋白膜，并用乙醇處理，然后分別用XRD、FTIR、拉曼光譜測(cè)定了乙醇處理前后的絲蛋白膜的分子結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，絲蛋白膜中的分子主要為α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為60% ～80%的乙醇處理后，分子構(gòu)象從無(wú)規(guī)卷曲向β-折疊的轉(zhuǎn)變，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%以下時(shí)膜發(fā)生溶解，而濃度太高時(shí)(體積分?jǐn)?shù)為99.7%)對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象基本沒(méi)有影響。

Lin Ma等［7］利用圓二色光譜及通過(guò)對(duì)蛋白原本的熒光性和外加疏水性熒光探針ANS后環(huán)境熒光性的研究，探討了絲素蛋白在醇(包括甲醇和乙醇)-水混合物中分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%之前，絲蛋白的分子構(gòu)象顯示的是無(wú)規(guī)卷曲，而醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%之后出現(xiàn)的是β-折疊構(gòu)象，說(shuō)明絲蛋白分子構(gòu)象在醇-水混合物中從無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊構(gòu)象，并且這種轉(zhuǎn)變與溶劑的微觀結(jié)構(gòu)有很密切的聯(lián)系。醇濃度較低時(shí)，由于水還是保持原本的四面體結(jié)構(gòu)所以對(duì)肽單元的溶解性幾乎沒(méi)有影響，而醇濃度較高時(shí)，醇水混合物中四面體式的水結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殒湕l狀的水結(jié)構(gòu)，使得肽單元之間為了減少與溶劑分子間接觸時(shí)的熱力學(xué)阻礙而形成分子內(nèi)氫鍵作用，從而誘導(dǎo)絲蛋白β-折疊構(gòu)象的形成。

醇類是最常見(jiàn)的能誘導(dǎo)絲蛋白分子構(gòu)象變化的有機(jī)溶劑。絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變本質(zhì)上是一個(gè)氫鍵重組過(guò)程，醇溶液對(duì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)作用分為兩部分，第一部分是使得分子鏈運(yùn)動(dòng)，第二部分是醇分子進(jìn)入絲蛋白分子鏈中，與絲蛋白分子間產(chǎn)生疏水相互作用，破壞絲蛋白原有氫鍵，從而使分子鏈重排，引起構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。絲蛋白溶液中由于分子鏈本身就有足夠的運(yùn)動(dòng)空間，醇對(duì)其分子構(gòu)象的誘導(dǎo)作用主要是第二部分，所以構(gòu)象轉(zhuǎn)變的程度與速度主要取決于醇的濃度。醇濃度越高，對(duì)原有氫鍵的破壞能力越強(qiáng)，構(gòu)象轉(zhuǎn)變速率越快。而對(duì)于再生絲蛋白膜，使膜溶脹以獲取分子鏈自由運(yùn)動(dòng)的空間是構(gòu)象轉(zhuǎn)變的前提，所以除了甲醇分子體積較小可以直接進(jìn)入絲蛋白膜中使其溶脹外，其他體積較大的醇類溶劑必須含有一定量的水使膜充分溶脹后才能完成對(duì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)作用。最近又有另外一種理論認(rèn)為，當(dāng)醇-水混合物中醇濃度較高時(shí)，四面體式的水結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殒湕l狀的水結(jié)構(gòu)，使得肽單元之間為了減少與溶劑分子間接觸時(shí)的熱力學(xué)阻礙而形成分子內(nèi)氫鍵作用，從而誘導(dǎo)絲蛋白β-折疊構(gòu)象的形成［7］。

1.2 酸類等溶劑的作用

Rangam Rajkhowa等［8］采用 FTIR 研究了甲酸、三氟乙酸對(duì)再生絲素蛋白膜二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。以三氟乙酸為溶劑制得的絲蛋白膜，β-折疊含量比絲素蛋白水溶液直接制得的膜稍高，而使用甲酸時(shí)，則比前兩者高很多，絲素蛋白膜幾乎成為水不溶性膜。但是不同溶劑制得的絲蛋白膜經(jīng)乙醇處理后β-折疊含量都超過(guò)50%，并且α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊的速率比無(wú)規(guī)卷曲快。

Sung-Won Ha 等［9］綜合采用 XRD、FTIR、13C NMR研究了絲素蛋白(SF)在甲酸或三氟醋酸(TFA)作用下，溶液和固態(tài)絲素蛋白的分子結(jié)構(gòu)。溶液態(tài)的絲素蛋白13C NMR分析表明，兩種混合絲蛋白溶液中都主要為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，甲酸/SF溶液中存在少量的β-折疊結(jié)構(gòu)或類似的有序結(jié)構(gòu)，而TFA/SF溶液中存在少量中間變換結(jié)構(gòu)。紅外光譜的測(cè)定結(jié)果顯示，從絲蛋白水溶液直接凍干的絲素蛋白和再生絲素蛋白膜都顯示無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象，甲醇處理后轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)，而再生甲酸/SF膜顯示的是β-折疊結(jié)構(gòu)，再生TFA/SF膜則同時(shí)包含無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊結(jié)構(gòu)。XRD分析數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明，甲酸比TFA更有利于絲蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)的形成。研究認(rèn)為，溶劑的選擇應(yīng)該是使絲蛋白在溶解過(guò)程中保持有序的silk I結(jié)構(gòu)而非促使β-折疊結(jié)構(gòu)的形成，然后在固化過(guò)程中形成β-折疊結(jié)構(gòu)，這樣才能使再生絲蛋白纖維具有更加優(yōu)異的力學(xué)性能。

莫春麗等［10］采用時(shí)間分辨全反射紅外光譜研究了醋酸蒸汽在再生絲素蛋白膜中的擴(kuò)散過(guò)程，及其對(duì)再生絲素蛋白膜構(gòu)象轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在醋酸蒸汽的作用下，絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱甩?折疊結(jié)構(gòu)，并證實(shí)了構(gòu)象轉(zhuǎn)變的根本原因在于醋酸分子充分滲透到絲蛋白聚合體中使絲蛋白原有氫鍵斷裂，并重組形成β-折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)絲素蛋白膜中水的存在可以加快醋酸分子的擴(kuò)散速度進(jìn)而影響分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。

Yu Suzuki等［11］采用NMR研究了絲素蛋白在六氟異丙醇(HFIP)和六氟丙酮三水合物(HFA)兩種溶劑，以及在水溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異。1H-13C異核單量子相干光譜表明，絲蛋白在水溶液中有典型的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而在HFIP和HFA中則為α-螺旋結(jié)構(gòu)。

許箐等［12］用拉曼光譜對(duì)LiBr溶解的再生蜘蛛絲蛋白膜的構(gòu)象進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示絲蛋白膜中同時(shí)包含α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲;紅外光譜顯示，用HFIP溶解的絲蛋白膜以無(wú)規(guī)和α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。

甲酸、醋酸等對(duì)絲蛋白的作用與醇類溶劑類似，它們都會(huì)促進(jìn)絲蛋白的分子構(gòu)象向β-折疊轉(zhuǎn)變，而六氟異丙醇、六氟丙酮、三氟乙酸、三氟醋酸等溶劑則會(huì)使溶液態(tài)的絲蛋白構(gòu)象保持在螺旋或者類螺旋的結(jié)構(gòu)，而在絲蛋白固化過(guò)程中轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)，從而有可能制得力學(xué)性能更好的再生絲蛋白材料性能。

2 金屬離子和pH值對(duì)天然絲蛋白分子構(gòu)象的影響

2.1 堿金屬離子的作用

Qing-Xia Ruan等［13］利用固態(tài)NMR及在此基礎(chǔ)上推廣的二維NMR-NMR相關(guān)分析，研究了鈉離子對(duì)絲素蛋白構(gòu)象的影響。當(dāng)鈉離子的濃度比家蠶腺體內(nèi)鈉離子的含量高很多時(shí)，部分絲蛋白的構(gòu)象會(huì)從螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣陆Y(jié)構(gòu)。絲素蛋白分子構(gòu)象的變化經(jīng)歷了螺旋或無(wú)規(guī)卷曲到類螺旋結(jié)構(gòu)、類β-折疊結(jié)構(gòu)、β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。鈉離子與絲蛋白的結(jié)合點(diǎn)可能為某種能促進(jìn)β-折疊構(gòu)象形成的氨基酸序列中的羰基氧原子，由于Na+—O結(jié)合力較弱，所以鈉離子對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的影響弱于鈣、銅、鉀離子。該課題組［14］還采用二維相關(guān)核磁共振技術(shù)研究了鉀離子對(duì)螺旋/無(wú)規(guī)卷曲、類螺旋、類β-折疊、β-折疊這4種構(gòu)象變化先后順序的影響。分析結(jié)果表明，隨著鉀離子濃度從0～3.7mg/g變化時(shí)，誘導(dǎo)了絲蛋白構(gòu)象從螺旋結(jié)構(gòu)向β-結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，并且變化順序?yàn)?螺旋/無(wú)規(guī)卷曲→類螺旋→類β-折疊→β-折疊，而繼續(xù)增加鉀離子濃度后，絲蛋白分子構(gòu)象又從β-結(jié)構(gòu)回到螺旋結(jié)構(gòu)。

Xin-Gui Li等［15］用圓二色光譜研究了金屬離子(Li+、Na+、K+)對(duì)再生絲素蛋白水溶液分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響，發(fā)現(xiàn)這幾種金屬離子都能使絲蛋白溶液從開(kāi)始的無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)整的β-折疊結(jié)構(gòu)，并且在Li+、Na+、K+三種離子濃度相同的情況下，它們對(duì)β-折疊結(jié)構(gòu)形成的作用效果K+＞Na+＞Li+。

陳新等［16］運(yùn)用時(shí)間分辨紅外光譜研究堿金屬鹽溶液對(duì)再生蜘蛛絲蛋白膜的分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響。發(fā)現(xiàn)鈉離子有助于加快β-折疊的形成，而鉀離子則有助于提高蜘蛛絲蛋白膜中β-折疊結(jié)構(gòu)的含量。動(dòng)力學(xué)分析表明，再生蜘蛛絲蛋白膜的構(gòu)象轉(zhuǎn)變由快慢兩相組成，其中較快相對(duì)應(yīng)于鏈段運(yùn)動(dòng)引起的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，而較慢相則對(duì)應(yīng)于整條大分子鏈的運(yùn)動(dòng)引起的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

堿金屬溶液對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象的誘導(dǎo)作用是通過(guò)堿金屬離子與某些氨基酸殘基片段中羰基氧原子的結(jié)合，改變?cè)薪z蛋白分子內(nèi)或分子間的作用，從而實(shí)現(xiàn)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。由于堿金屬離子(或水化離子)半徑的差異，使它們對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)作用也有所不同［13］。

2.2 銅離子的作用

二價(jià)銅離子對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象的影響在諸多金屬離子中較為顯著，因此備受關(guān)注。

Xiao-Hong Zong等［17］綜合13C NMR、拉曼光譜及Cu(Ⅱ)離子的EPR研究了pH值和銅離子對(duì)絲素蛋白分子構(gòu)象的影響。拉曼光譜的定性分析和13C NMR的定量分析表明，加入適量的銅離子會(huì)誘導(dǎo)絲蛋白分子構(gòu)象從silkⅠ向silkⅡ轉(zhuǎn)變，并且這種轉(zhuǎn)變受pH值影響。隨著 pH值從8.0降到5.2，silkⅡ(包括與silkⅡ相關(guān)的中間態(tài)結(jié)構(gòu))的含量增加了1倍多，說(shuō)明弱酸性環(huán)境更有利于silkⅡ結(jié)構(gòu)的形成。Cu(Ⅱ)的EPR結(jié)果顯示:pH值從6.9減小到5.2時(shí)，銅離子與絲素蛋白的絡(luò)合方式也發(fā)生了從Cu—3N1O到Cu—2N2O和Cu—1N3O的轉(zhuǎn)變，所以構(gòu)象的改變和銅離子與絲素蛋白的絡(luò)合方式有密切關(guān)系。不同pH值下，當(dāng)銅離子濃度從0.09增大到1.8 mg(Cu)/g(SF)時(shí)，silkⅡ含量都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，只是pH值不同時(shí)，silkⅡ含量達(dá)到最大值時(shí)的銅離子濃度不一樣。在pH值為5.2時(shí)，silkⅡ含量最高的銅離子濃度對(duì)應(yīng)的Cu—2N2O絡(luò)合方式的含量也最多，銅離子濃度繼續(xù)增加時(shí)，Cu—2N2O絡(luò)合方式的含量也減少。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明銅離子與絲素蛋白絡(luò)合方式及分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變間存在密切關(guān)系，并且Cu—2N2O絡(luò)合方式可能與silkⅡ構(gòu)象的形成有關(guān)，而Cu—1N3O絡(luò)合方式可能導(dǎo)致了silkⅠ以及與silkⅠ相關(guān)的中間態(tài)結(jié)構(gòu)的形成。

宗小紅等［18］利用遠(yuǎn)紫外圓二色光譜研究了水溶液中Cu(Ⅱ)離子對(duì)絲素蛋白構(gòu)象的影響，結(jié)果表明溶液中加入二價(jià)銅離子后，絲蛋白分子構(gòu)象由原來(lái)的無(wú)規(guī)卷曲向β-折疊轉(zhuǎn)變，但當(dāng)二價(jià)銅離子濃度太大時(shí)β-折疊構(gòu)象含量反而減少，并且Cu(Ⅱ)離子對(duì)絲素蛋白構(gòu)象的影響遵循“成核依賴性”機(jī)理，這與存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的朊蛋白在Cu(Ⅱ)離子誘導(dǎo)下的病變過(guò)程非常相似，從而可以為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供幫助。

鐘一鳴等［19］綜合外加疏水性熒光探針ANS和熒光猝滅等多種熒光分析手段，及遠(yuǎn)紫外圓二色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了Cu(Ⅱ)離子誘導(dǎo)絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的機(jī)理。Cu(Ⅱ)離子可能通過(guò)與再生絲素蛋白水溶液中的疏水區(qū)域直接絡(luò)合，破壞結(jié)合點(diǎn)原有的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)絲素蛋白發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變以形成穩(wěn)定的β-折疊構(gòu)象，并且銅離子除了會(huì)和絲素蛋白的組氨酸殘基絡(luò)合外，還會(huì)與色氨酸殘基發(fā)生可逆絡(luò)合。

二價(jià)銅離子雖然和醇類溶劑類似，是通過(guò)破壞絲蛋白原有疏水結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來(lái)誘導(dǎo)分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，但是醇類溶劑的破壞區(qū)域是體系中大量存在的疏水相互作用，而二價(jià)銅離子則是與絲蛋白分子中特定的點(diǎn)直接進(jìn)行絡(luò)合。

2.3 鐵及其他離子的作用

Dan Ji等［2］研究了鐵離子和亞鐵離子對(duì)絲蛋白折疊過(guò)程的誘導(dǎo)作用，采用固態(tài)13C NMR、拉曼光譜及鐵離子的EPR分析鐵離子/亞鐵離子對(duì)絲蛋白的折疊過(guò)程的影響。NMR和拉曼光譜的結(jié)果顯示，鐵離子和亞鐵離子對(duì)絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響是不同的。當(dāng)鐵離子濃度超過(guò)臨界值時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)從螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，而亞鐵離子則不能。從絲蛋白silkⅡ含量隨鐵離子濃度的變化曲線中看出，當(dāng)濃度達(dá)到75.0 μg/g時(shí)，silkⅡ含量才顯著的增加，說(shuō)明較少含量的鐵離子可以使絲蛋白中螺旋結(jié)構(gòu)與β-折疊結(jié)構(gòu)的比例保持基本不變，但含量再增加，由于鐵離子與非結(jié)晶空隙部分的某些特殊殘基的相互作用而產(chǎn)生更多的β-折疊結(jié)構(gòu)。一旦折疊模式形成，折疊發(fā)生的速度就會(huì)因?yàn)榻z蛋白中疏水部分間強(qiáng)烈的疏水作用而急劇加快，從而導(dǎo)致β-折疊部分的集聚，折疊過(guò)程具有成核依賴性。拉曼光譜中I850/I830值可以反映出酪氨酸相關(guān)區(qū)域的微環(huán)境，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)可以得到二級(jí)結(jié)構(gòu)和酪氨酸相關(guān)區(qū)域微環(huán)境的相關(guān)信息，當(dāng)絲蛋白處于螺旋構(gòu)象時(shí)，I850/I830值為3.25，說(shuō)明酪氨酸相關(guān)區(qū)域?yàn)槊黠@的疏水環(huán)境，而處于較松散的過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)，如:類螺旋或類β-折疊時(shí)，I850/I830值降為2.3左右，但還是處于疏水范圍，說(shuō)明酪氨酸相關(guān)區(qū)域?yàn)橹卸仁杷h(huán)境，當(dāng)絲蛋白處于β-折疊結(jié)構(gòu)時(shí)，I850/I830值又回到3.3，此時(shí)酪氨酸相關(guān)區(qū)域?yàn)槊黠@的疏水環(huán)境。

Ping Zhou等［20］利用二維拉曼相關(guān)光譜及13C固態(tài)NMR研究了鈣離子對(duì)絲素蛋白分子構(gòu)象從silk I到silkⅡ轉(zhuǎn)變的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鈣離子濃度在10 mg/g時(shí)，silkⅡ(包括與silkⅡ相關(guān)的中間態(tài)結(jié)構(gòu))的含量達(dá)到最大值，而繼續(xù)增加鈣離子濃度其含量反而減少，說(shuō)明鈣離子濃度較高時(shí)會(huì)抑制silkⅡ構(gòu)象的形成，這可能是因?yàn)殁}離子濃度較高時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)凝膠的形成。pH值與鈣離子濃度的混合作用研究表明，silkⅡ構(gòu)象最高含量仍出現(xiàn)在鈣離子濃度為10mg/g時(shí)，并且該鈣離子濃度下，隨著pH值的增加，silkⅡ構(gòu)象含量減少。雖然在鈣離子濃度小于10mg/g時(shí)，對(duì)silkⅡ構(gòu)象的形成有促進(jìn)作用，但是即使在silkⅡ構(gòu)象含量總體最高的條件下，silkⅠ構(gòu)象含量還是占主導(dǎo)位置，所以需要其他條件，比如拉伸流動(dòng)、剪切力、其他金屬離子的作用等來(lái)完成從silkⅠ到silkⅡ的轉(zhuǎn)變。

周文等［21］采用拉曼光譜研究Fe(III)和Mn(II)對(duì)高濃度再生絲素蛋白水溶液中絲蛋白構(gòu)象的影響，研究表明Fe(III)能夠誘導(dǎo)絲蛋白的構(gòu)象由無(wú)規(guī)線團(tuán)和(或)螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊轉(zhuǎn)變，機(jī)理與Cu(Ⅱ)相似，但是Mn(II)對(duì)絲蛋白的構(gòu)象沒(méi)有明顯的影響。

鐵離子和鈣離子由于與絲蛋白分子的絡(luò)合點(diǎn)不同，對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象的影響有很大差異，鐵離子的加入有助于β-折疊構(gòu)象的形成，而鈣離子雖然可以增加β-折疊結(jié)構(gòu)的含量，但是絲蛋白溶液中還是以silkⅠ為主，說(shuō)明鈣離子有利于維持絲蛋白在溶液中的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

2.4 pH值的作用

pH值是通過(guò)改變絲蛋白所帶電荷的情況來(lái)影響絲蛋白分子間的排列，從而使構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變。

Ping Zhou等［20］利用二維拉曼相關(guān)光譜及13C固態(tài)NMR研究發(fā)現(xiàn)，在pH值較低時(shí)，促進(jìn)了silkⅡ結(jié)構(gòu)的形成;而pH值較高時(shí)，分子構(gòu)象保持了silk I結(jié)構(gòu)的特征，并且pH值對(duì)分子構(gòu)象的影響是質(zhì)子化作用的結(jié)果，pH值減少導(dǎo)致質(zhì)子增多，使氨基酸側(cè)鏈所帶負(fù)電荷減少，分子鏈間更容易靠近形成氫鍵作用，再加上固化過(guò)程中水的排出，使得分子間排列更規(guī)整而發(fā)生重折疊。

Wei Wei［22］等利用一種新型的毛細(xì)管干法紡絲裝置模擬了蠶的吐絲過(guò)程，并研究了pH值對(duì)分子構(gòu)象的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低pH值(接近絲蛋白的等電點(diǎn))有助于 β-折疊分子的形成。Xin-Gui Li等［15］也證實(shí)了這一點(diǎn)。

3 溫度和絲蛋白濃度對(duì)天然絲蛋白分子構(gòu)象的影響

彭顯能等［23］用二維相關(guān)紅外光譜研究再生絲素蛋白膜的構(gòu)象與溫度之間的關(guān)系。將樣品從130℃升溫到220℃或在180℃的恒溫過(guò)程中，絲素蛋白分子鏈的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化。二維相關(guān)光譜證實(shí)了構(gòu)象變化響應(yīng)順序?yàn)?先是無(wú)規(guī)線團(tuán)的“崩潰”及氧化過(guò)程的發(fā)生，然后才是β-折疊或α-螺旋結(jié)構(gòu)的增加和完善。

Wei Tao等［24］研究了再生柞蠶絲素蛋白水溶液中的分子構(gòu)象，并研究了溫度和絲蛋白濃度對(duì)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過(guò)程中構(gòu)象變化的影響。通過(guò)圓二色、13C NMR、拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，絲蛋白水溶液的分子構(gòu)象主要為α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，并存在少量的β-折疊結(jié)構(gòu)，這與桑蠶絲素蛋白水溶液只有無(wú)規(guī)卷曲而沒(méi)有α-螺旋構(gòu)象不同。隨著溫度和溶液濃度的增加，凝膠速度增加，凝膠過(guò)程中柞蠶絲素蛋白從無(wú)規(guī)卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

Jin Nam等［3］研究了再生絲素蛋白在不同凝固溫度下的分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變情況，XRD和FTIR數(shù)據(jù)表明，較高凝固溫度下絲蛋白中出現(xiàn)了較少的β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，總體說(shuō)來(lái)溫度從-60℃升高到-10℃對(duì)分子構(gòu)象幾乎沒(méi)有影響。

Xin-Gui Li等［15］用圓二色光譜及紫外-可見(jiàn)吸收光譜研究發(fā)現(xiàn)，改變?nèi)芤簻囟群蜐舛龋偕z素蛋白溶液的分子構(gòu)象會(huì)從開(kāi)始的無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)整的β-折疊結(jié)構(gòu)，并且β-折疊構(gòu)象含量隨著溶液濃度和溫度的升高而增加。

溫度通過(guò)提供能量讓分子鏈熱運(yùn)動(dòng)、重新排列從而實(shí)現(xiàn)分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。絲蛋白濃度較大時(shí)可以使分子間距減小，更有利于β-折疊結(jié)構(gòu)的形成。這兩種因素對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象的作用較溶劑、金屬離子、pH值都小。

4 剪切力等外力對(duì)天然絲蛋白分子構(gòu)象的影響

Chang Seok Ki等［25］通過(guò) CD、FTIR 及固體13C NMR研究了絲膠(SS)在剪切條件下對(duì)絲素(SF)溶液構(gòu)象的影響。剪切前SS/SF混合溶液或膜都主要呈無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象，但隨著SS含量的增加β-折疊片段的含量有所增加;剪切后得到的沉積物，F(xiàn)TIR顯示典型的β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，而NMR顯示，除了β-折疊外，分子中還保留有一定量的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu);剪切后殘余的SF/SS溶液，CD顯示的主要還是無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而FTIR和NMR分析結(jié)果則不同:加入SS后分子構(gòu)象主要為β-折疊，并且當(dāng)SS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)含量最高，這種差異主要是因?yàn)镃D測(cè)試的是溶液，而FTIR和NMR測(cè)試的則是溶液固化后得到的膜。

Xin-Gui Li等［26］用圓二色光譜、拉曼光譜、紅外光譜等研究了超聲波或擠出處理對(duì)再生絲素蛋白溶液分子構(gòu)象的影響，發(fā)現(xiàn)相比溫度、蛋白濃度、pH值、金屬離子等，超聲波或擠出處理對(duì)分子構(gòu)象的影響更大，處理后無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量會(huì)穩(wěn)步減少而β-折疊結(jié)構(gòu)含量則顯著增加，并且擠出處理相比超聲波處理更能得到高含量的β-折疊結(jié)構(gòu)。在偏振顯微鏡下可以觀察到，擠出處理后水溶液會(huì)出現(xiàn)液晶態(tài)，說(shuō)明剪切力作用對(duì)絲蛋白分子在水溶液中形成液晶態(tài)規(guī)整的β-折疊構(gòu)象起到了關(guān)鍵的作用。

蠶或蜘蛛吐絲過(guò)程就是絲蛋白在外力作用下由無(wú)規(guī)卷曲或螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變的過(guò)程，所以外力作用是影響絲蛋白分子構(gòu)象的一個(gè)重要因素，并且這種外力作用往往比其他因素的影響更大。

5 結(jié)語(yǔ)

誘導(dǎo)絲蛋白分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變的外源因素中，除了剪切力等外力作用外，溶劑和金屬離子是較為重要的兩個(gè)因素。本質(zhì)上這兩者都是通過(guò)破壞絲蛋白原有疏水結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來(lái)誘導(dǎo)分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，只是兩者的作用區(qū)域不同，溶劑的破壞區(qū)域是體系中大量存在的疏水相互作用，而金屬離子則是與絲蛋白分子中特定的點(diǎn)直接進(jìn)行絡(luò)合。與絲蛋白分子的作用點(diǎn)及其離子(或水化離子)半徑的差異，使不同種類的金屬離子對(duì)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響也有所不同，其中銅離子和鉀離子對(duì)形成β-折疊結(jié)構(gòu)的作用較為顯著;溶劑中，醇類溶劑可以通過(guò)對(duì)再生絲蛋白材料進(jìn)行后處理使其分子構(gòu)象β-折疊化，而六氟異丙醇等有機(jī)溶劑則有利于絲蛋白在溶液狀態(tài)時(shí)保持穩(wěn)定的silk I構(gòu)象。較低的pH值可以促進(jìn)β-折疊的形成，而溫度與絲蛋白濃度對(duì)絲蛋白分子構(gòu)象的影響較小。

再生天然絲蛋白材料由于其廣闊的應(yīng)用前景受到了越來(lái)越多的關(guān)注，對(duì)絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，了解溶劑、金屬離子等外源性因素對(duì)絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，可以為高性能再生天然絲蛋白材料的制備條件提供優(yōu)化的指導(dǎo)性信息。

［1］LEFEVRE T，BOUDREAULT S，CLOUTIER C，et al.Diversity ofmoleculartransformationsinvolved in the formation of spider silk［J］.Journal of Molecular Biology，2011，405(1):236-253.

［2］JI D，DENG Y B，ZHOU P.Folding process of silk fibroin induced by ferric and ferrous ions［J］.Journal of Molecular Structure，2009，938(1):305-310.

［3］NAM J，PARK Y H.Morphology of regenerated silk fibroin:effectsoffreezing temperature，alcoholaddition and molecular weight［J］.Journal of Applied Polymer Science，2001，81(12):3008-3021.

［4］陳新，周麗，邵正中，等.時(shí)間分辨紅外光譜對(duì)絲蛋白膜構(gòu)象轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)的研究:再生蠶絲蛋白膜在高濃度醇溶液中的構(gòu)象轉(zhuǎn)變［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，61(4):625-629.CHEN Xin，ZHOU Li，SHAO Zhengzhong，et al.Conformation transition of silk protein membranes monitored by time-resolved FT-IR spectroscopy:Conformation transition behavior of regenerated silk fibroin membranes in alcohol solution at high concentration［J］.Acta Chimica Sinica，2003，61(4):625-629.

［5］CHEN X，SHAO Z Z，KNIGHT D P，et al.Conformation transition kineticsofBombyx morisilk protein［J］.Proteins:Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，2007，68(1):223-231.

［6］ZHENG Z H，WEI Y Q，YAN S Q，et al.Preparation of regenerated Antheraea yamamaisilk fibroin film and controlled-molecular conformation changes by aqueous ethanol treatment［J］.Journal of Applied Polymer Science，2010，116(1):461-467.

［7］MA L，HE W R，HUANG A M，et al.Mechanism of conformational transition of silk fibroin in alcohol-water mixtures［J］.Chinese Journal Chemistry，2011，29(5):877-882.

［8］RAJKHOWA R， LEVIN B， REDMOND S L， et al.Structure and properties of biomedical films prepared from aqueous and acidic silk fibroin solutions［J］.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2011，97(1):37-45.

［9］HA S W，TONELLI A E，HUDSON S M.Structural studies of Bombyx morisilk fibroin during regeneration from solutions and wet fiber spinning［J］.Biomacromolecules，2005，6(3):1722-1731.

［10］莫春麗，DICKO Cedric，邵正中，等.時(shí)間分辨全反射紅外光譜對(duì)醋酸誘導(dǎo)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，67(22):2641-2644.MO Chunli，DICKO Cedric，SHAO Zhengzhong，et al.Time-resolved total reflectance FT-IR spectroscopy characterization on conformational change of silk fibroin induced by acetic acid［J］.Acta Chimica Sinica，2009，67(22):2641-2644.

［11］SUZUKI Y，GERIG J T，ASAKURA T.NMR study of interactions between silk model peptide and fluorinated alcohols for preparation of regenerated silk fiber［J］.Macromolecules，2010，43(5):2364-2370.

［12］許箐，潘志娟，錢(qián)丹娜，等.不同工藝條件下再生蜘蛛絲蛋白的分子結(jié)構(gòu)［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(2):10-14.XU Jing，PAN Zhijuan，QIAN Danna，et al.Molecular structure of regenerated spider silk protein［J］.Journal of Soochow University，2005，25(2):10-14.

［13］RUAN Q X，ZHOU P.Sodium ion effect on silk fibroin conformation characterized by solid-state NMR and generalized 2D NMR-NMR correlation［J］.Journal of Molecular Structure，2009，883/884:85-90.

［14］RUAN Q X，ZHOU P，HU B W，et al.An investigation into the effect of potassium ions on the folding of silk fibroin studied by generalized two-dimensional NMR-NMR correlation and Raman spectroscopy［J］.FEBS Journal，2008，275(2):219-232.

［15］LI X G，WU L Y，HUANG M R，et al.Conformational transition and liquid crystalline state of regenerated silk fibroin in water［J］.Biopolymers，2008，89(6):497-505.

［16］陳新，邵正中，KNIGHT David P，等.時(shí)間分辨紅外光譜對(duì)絲蛋白膜構(gòu)象轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)的研究:不同堿金屬離子對(duì)蜘蛛絲蛋白膜構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2002，60(12):2203-2208.CHEN Xin，SHAO Zhengzhong，KNIGHT David P，et al.Conformation transition of silk protein membranes monitored by time-resolved FTIR spectroscopy:effect of alkali metal ions on Nephila spidroin membrane［J］.Acta Chimica Sinica，2002，60(12):2203-2208.

［17］ZONG X H，ZHOU P，SHAO Z Z，et al.Effect of pH and copper(II)on the conformation transitions of silk fibroin based on EPR，NMR，and raman spectroscopy［J］.Biochemistry，2004，43(38):11932-11941.

［18］宗小紅，周平，邵正中，等.再生絲素蛋白在水溶液中構(gòu)象轉(zhuǎn)變的 Cu(II)離子效應(yīng)［J］.科技通報(bào)，2005，50(11):1080-1084.ZONG Xiaohong，ZHOU Ping，SHAO Zhengzhong，et al.EffectofCu(II)on the conformation transitions of regenerated silk fibroin in water［J］.Bulletin of Science and Technology，2005，50(11):1080-1084.

［19］鐘一鳴，楊宇紅，陳新，等.銅離子對(duì)水溶液中再生絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)作用［J］.高分子學(xué)報(bào)，2009(10):1056-1060.ZHONG Yiming，YANG Yuhong，CHEN Xin，et al.Cu(II)-induced conformation transition of regenerated silk fibroin in aqueous solutions［J］.Acta Polymerica Sinica，2009(10):1056-1060.

［20］ZHOU P，XIE X，KNIGHT D P，et al.Effects of pH and Calcium ions on the conformational transitions in silk fibroin using 2D Raman correlation spectroscopy and13C Solid-State NMR［J］.Biochemistry，2004，43(35):11302-11311.

［21］周文，郁芳，邵正中，等.鐵和錳對(duì)桑蠶絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，65(19):2197-2201.ZHOU Wen，YU Fang，SHAO Zhengzhong，et al.Effect of Fe and Mn on the conformation transition of Bombyx mori silk fibroin［J］.Acta Chimica Sinica，2007，65(19):2197-2201.

［22］WEI W，ZHANG Y P，ZHAO Y M，et al.Bio-inspired capillary dry spinning of regenerated silk fibroin aqueous solution［J］.Materials Science and Engineering C，2011，31(7):1602-1608.

［23］彭顯能，陳新，武培怡，等.二維相關(guān)紅外光譜研究再生蠶絲蛋白膜的構(gòu)象與溫度之間的關(guān)系［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2004，62(21):2127-2130.PENG Xianneng，CHEN Xin，WU Peiyi，et al.Investigation on the conformation transition of regenerated silk fibroin films under thermal treatment by two-dimensional(2D)correlation FT-IR spectroscopy［J］.Acta Chimica Sinica，2004，62(21):2127-2130.

［24］TAO W，LI M Z，ZHAO C X.Structure and properties of regenerated Antheraea pernyi silk fibroin in aqueous solution［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2007，40(5):472-478.

［25］KI C S，UM I C，PARK Y H.Acceleration effect of sericin on shear-induced β-transition of silk fibroin［J］.Polymer，2009，50(19):4618-4625.