王鍵，龔顏，曾榮，魏勁松

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科，廣東湛江524001）

·綜述·

去勢雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究

王鍵，龔顏，曾榮，魏勁松

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科，廣東湛江524001）

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)主要表現(xiàn)為骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退行性改變等特征，以致骨脆性、骨折危險(xiǎn)性增加的代謝性全身骨骼疾病。合適的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型是研究骨質(zhì)疏松癥的重要基礎(chǔ)。本文就絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松雌性大鼠模型復(fù)制的基本方法、月齡和造模的選擇及常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)特點(diǎn)簡要綜述，為研究去勢骨質(zhì)疏松疾病動(dòng)物的正確選擇提供參考。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松；大鼠；動(dòng)物模型

骨質(zhì)疏松（Osteoporosis，OP）是多病因引起的，以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退行性改變?yōu)樘卣?，以致骨脆性、骨折危險(xiǎn)性增加的代謝性全身骨骼疾病。OP按病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性三類，其中，Ⅰ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，發(fā)生于絕經(jīng)后女性人群中，其主要病理機(jī)制與破骨細(xì)胞骨吸收功能活躍為主因的骨重建失去平衡有關(guān)。在研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的藥理、機(jī)制等過程中，諸如小鼠、大鼠、兔、狗、豬、羊等[1]動(dòng)物模型都有被采用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合理的選擇要求符合方便性、相關(guān)性和適宜性三大原則，且具有可重復(fù)性的穩(wěn)定性，盡量使OP在組織病理學(xué)上與人類表現(xiàn)一致。而大鼠去勢后骨礦含量下降、骨吸收迅速增加[2]、骨骼強(qiáng)度下降[3]等表現(xiàn)均與人類有眾多的相似之處，相對(duì)其他動(dòng)物模型來說，具有繁殖快、花費(fèi)低、易于飼養(yǎng)和管理、遺傳背景明確等優(yōu)點(diǎn)，已被作為最常用的動(dòng)物模型，現(xiàn)廣泛運(yùn)用于評(píng)價(jià)和開發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療新藥等研究[4]。本文就近幾年骨質(zhì)疏松研究中雌性大鼠去勢模型的研究綜述如下：

1 大鼠種類的選擇

實(shí)驗(yàn)用大鼠分遠(yuǎn)交和近交系，其中遠(yuǎn)交系有Spraque-Dauley、Wistar、Holtzman、Long-Evans等，近交系包括Fischer344、ACI、Brown-Norway、Wistar-Furth、Lewis等品種。目前最常用的是Wistar大鼠和Spraque-Dauley大鼠（SD大鼠）。

2 模型制備方法

目前國內(nèi)外研究大多使用經(jīng)典的手術(shù)切除雙側(cè)卵巢造模，該模型很好地模擬出人體雌激素下降造成的破骨細(xì)胞活動(dòng)加速、成骨細(xì)胞功能代償性增強(qiáng)的高轉(zhuǎn)換型骨代謝等特點(diǎn)[5]，而且處理因素單一，成模效果肯定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性好，可較快地復(fù)制出OP模型。但臨床OP患者在絕經(jīng)后卵巢間質(zhì)細(xì)胞仍有一定程度的內(nèi)分泌功能[6]；其次，與人類骨骼相比，大鼠皮質(zhì)骨缺乏Haversian系統(tǒng)及皮質(zhì)內(nèi)改建[7]，不適于用作研究臨床上卵巢切除術(shù)對(duì)皮質(zhì)骨影響的模型；最后，手術(shù)造模是一項(xiàng)創(chuàng)傷性操作，難免會(huì)引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、電解質(zhì)紊亂等[8]。以上的模型缺點(diǎn)都可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生一定影響，限制了該模型完全模擬臨床OP的應(yīng)用。

不摘除卵巢而是給予藥物，會(huì)造成體內(nèi)雌激素的含量減少，經(jīng)過一定時(shí)間后，也可以造成動(dòng)物的骨丟失?？捎玫乃幬镉写冱S體激素釋放激素激動(dòng)劑[1，9](Luteinizing hormone-releasing hormone agonist，LHRHAs)、促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑[10](GnRH agonist)以及非甾體類雄激素拮抗劑[1，5]等，均可使體內(nèi)雌二醇減少，達(dá)到藥物模擬去勢的效果。給藥法雖然不產(chǎn)生動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)、電解質(zhì)紊亂等問題，但是這種方法可能涉及兩種或更多激素之間的作用，并且藥物副作用不可避免，這些可能會(huì)與研究處理因素產(chǎn)生相互影響，成模效果不確定，人為地增大實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性，因此降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度，實(shí)際應(yīng)用有限。

3 造模大鼠月齡和成模時(shí)間的選擇

一般而言，大鼠2個(gè)月齡時(shí)性成熟，17～18個(gè)月齡后進(jìn)入老年期，平均壽命3年。合適月齡的大鼠對(duì)于OP的實(shí)驗(yàn)研究十分關(guān)鍵。

對(duì)正常非手術(shù)未孕產(chǎn)的雌性大鼠，王曉等[5]比較后認(rèn)為，3～6個(gè)月齡骨生長活躍；6、7個(gè)月齡骨骺出現(xiàn)封閉，骨代謝相對(duì)穩(wěn)定；10個(gè)月齡后出現(xiàn)峰值骨量；而骨生物力學(xué)效能達(dá)峰值12個(gè)月齡時(shí)才出現(xiàn)；12～16個(gè)月齡則更多地表現(xiàn)為骨量的快速丟失。因此針對(duì)不同月齡的特點(diǎn)，可以通過對(duì)3～6個(gè)月齡大鼠施加不同的因素，研究骨量形成的影響；在骨代謝相對(duì)穩(wěn)定的6、7個(gè)月齡大鼠，不僅可施加手術(shù)去勢、藥物干預(yù)、懸吊固定等處理來觀察實(shí)驗(yàn)因素對(duì)骨質(zhì)平衡的影響，也可以長期藥物喂養(yǎng)，研究藥理對(duì)OP的預(yù)防作用；12個(gè)月齡之后的大鼠由于主要表現(xiàn)在骨量的丟失，因此適合用于老年人骨量峰值過后骨質(zhì)丟失治療的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。由于去勢后的長期雌激素缺乏，16～24個(gè)月齡的大鼠乳腺腫瘤的發(fā)病率上升[11]，已不適用于骨代謝治療的研究。

目前大多學(xué)者采用3～9個(gè)月齡的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。有學(xué)者對(duì)不同月齡大鼠卵巢切除術(shù)后觀察比較指出[12-14]，3個(gè)月齡大鼠骨骼還處于生長期，在術(shù)后2個(gè)月內(nèi)骨礦含量仍有增加，6～8個(gè)月齡鼠大鼠骨峰形成相對(duì)穩(wěn)定，性激素減少導(dǎo)致骨質(zhì)的變化更符合絕經(jīng)后女性的變化規(guī)律，而12個(gè)月齡的SD大鼠由于骨密度與骨鈣含量的變化較小，因此適宜用于復(fù)制老年性的骨質(zhì)疏松。

由于成年大鼠的骨重建周期為30～40 d[15]，理論上去勢處理后1～2個(gè)月內(nèi)即可進(jìn)行藥物干預(yù)。劉曉青等[16]通過去勢后4周、12周和18周的觀察，發(fā)現(xiàn)去卵巢前4周時(shí)間內(nèi)骨量降低最快，隨后速度減慢?？紤]到即使在去卵巢后，大鼠的骨形成和骨吸收的變化也受到其月齡增長的影響，因此術(shù)后1個(gè)月較適宜運(yùn)用于藥物治療的實(shí)驗(yàn)處理。

已產(chǎn)仔的雌性大鼠，因動(dòng)物在孕期和哺乳過程中，體內(nèi)對(duì)鈣需求高于正常，多有可能出現(xiàn)骨骼生長緩慢，以及影響實(shí)驗(yàn)中血鈣等數(shù)值的測量。因此在一般的OP治療的研究中，應(yīng)盡量選用未孕產(chǎn)的雌性大鼠，避免上述因素的干擾。

綜上所述，不同種族的大鼠雖然生活習(xí)性和生長曲線不盡相同，但都可以成功的制作出模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的模型。考慮到去勢后飼養(yǎng)和藥物治療的時(shí)間對(duì)大鼠的月齡也會(huì)造成影響，選擇6個(gè)月齡大鼠去除卵巢后1個(gè)月比較適用于藥物治療OP的實(shí)驗(yàn)研究。此時(shí)大鼠術(shù)后的骨量丟失明顯，骨吸收活躍，耦聯(lián)骨形成增加明顯，形成高轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松特點(diǎn)，較符合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的特點(diǎn)，制模時(shí)間較短，成模效果肯定，可以較好地節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。

4 大鼠模型較常用的部分評(píng)價(jià)和判斷指標(biāo)

4.1 反映卵巢切除的指標(biāo)卵巢是否成功切除干凈，不僅要將切除物組織鏡檢，還要通過術(shù)后連續(xù)兩周的每天陰道分泌物涂片鏡，觀察子宮內(nèi)膜組織學(xué)變化，一般來說，大鼠性周期為96～120 h，可以在術(shù)后較快地明確雙側(cè)卵巢切除是否徹底。也可在處死大鼠后行子宮質(zhì)量稱重和子宮系數(shù)的比較，進(jìn)一步從功能上說明卵巢切除成功，雌激素減退。子宮系數(shù)=子宮質(zhì)量/體質(zhì)量[17]。血液的改變主要表現(xiàn)在雌二醇的變化，可以通過測定血清雌二醇來證明達(dá)到絕經(jīng)后的標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 骨量變化的常用指標(biāo)按照中國人原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，要求骨量丟失大于均值的25%才可診斷為OP，因此骨密度的測量為必須反映骨質(zhì)疏松造模成功與否的指標(biāo)，該標(biāo)準(zhǔn)目前主要以DXA (雙能X線吸收法)為手段制定，輔以多種方法的應(yīng)用。因此，骨礦含量(Bone mineral content，BMC)、骨密度(Bone mineral density，BMD)等常成為人們?cè)炷５谋剡x指標(biāo)之一。這些指標(biāo)除了運(yùn)用DXA骨密度儀，也可選用采用單光子(SPA)、雙光子吸收法(DPA)和定量CT(pQCT)等技術(shù)，評(píng)估體內(nèi)BMC和BMD。采用影像學(xué)方法最大的優(yōu)點(diǎn)是無損傷性。其中SPA較簡便價(jià)廉，不能檢測中軸骨[18]，通常用于橈骨（非優(yōu)勢臂）、跟骨、掌骨或指骨測定；而DXA分辨好，可以排除軟組織的干擾，提高了靈敏度與精確度；有條件也可運(yùn)用CT三維重建技術(shù)對(duì)骨密度做更直觀的觀察。但由于體內(nèi)各部位的骨量丟失不盡一致[19]，在多部位檢測骨密度時(shí)應(yīng)注意造模時(shí)間對(duì)不同部位出現(xiàn)骨質(zhì)流失的影響。除了影像學(xué)方法，也可通過標(biāo)本骨組織直接取材，進(jìn)行脫鈣骨組織病理學(xué)檢查，該方法可以從組織學(xué)的角度發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)的受損。也可行熒光標(biāo)記后，染色切片觀察，其中較為常用的反映骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)有代表骨量的骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(%Tb.Ar)、反映骨結(jié)構(gòu)參數(shù)的骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)等；反映骨轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)指標(biāo)包括反映骨形成活力的熒光標(biāo)記周長百分?jǐn)?shù)（L.Pm%）、骨礦化沉積率(MAR)、單位長度骨小梁表面上骨形成率(BFRPBS)、單位骨小梁面積骨形成率(BFRPBV)以及反映骨吸收活躍程度的單位骨小梁面積上破骨細(xì)胞數(shù)量(Oc1N)、單位骨小梁面積上破骨細(xì)胞周長百分?jǐn)?shù)(%Oc1Pm)[16]。有條件運(yùn)用掃描電鏡更能發(fā)現(xiàn)骨小梁密集程度、小梁間距、膠原數(shù)量、皮質(zhì)區(qū)鈣鹽沉積、鈣鹽顆粒密集度等的變化[17]。而且病理切片快捷、經(jīng)濟(jì)，測量結(jié)果與DEXA數(shù)據(jù)有高度相關(guān)性，與骨生物力學(xué)功能改變吻合良好，在骨質(zhì)疏松模型及藥效評(píng)價(jià)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值[5]。

4.3 骨代謝的常用生化指標(biāo)除了較常用的血鈣尿鈣、血磷尿磷和尿肌酐外，還包括成骨功能的指標(biāo)和反映骨吸收功能的指標(biāo)。骨形成標(biāo)志物有：血清骨堿性磷酸酶(ALP)、骨堿性磷酸酶（BAP）、血清骨鈣素(BGP)、血清I型前膠原氨基末端肽N-端(PINP)、血清I型前膠原氨基末端肽C-端(PICP)等。骨吸收生化標(biāo)志物有：血抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、Ⅰ型膠原羧基交聯(lián)肽C-端(CTX-Ⅰ)、尿脫氧吡啶啉(DPD)、血清I型膠原交聯(lián)氨基末端肽N-端(NTX)、羥脯氨酸(Hyp)等。其中，BGP是由成骨細(xì)胞合成和分泌入血的，血清中的OC水平與骨組織中的水平呈正相關(guān)，可直接反映成骨細(xì)胞的活性和骨生理代謝變化[20]。而CTX在骨質(zhì)疏松治療前后變化率較大，而長期個(gè)體內(nèi)變異又較小，穩(wěn)定而又靈敏，可以作為評(píng)判治療效果的首選指標(biāo)[5]。由于骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)的變化較病理變化早，一般在術(shù)后1～2.5個(gè)月就有明顯變化，因此骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)可以作為反映絕經(jīng)后早期骨量丟失的靈敏指標(biāo)[21]，有助于造模的預(yù)測性診斷。

4.4 骨生物力學(xué)的常用指標(biāo)常用的骨生物力學(xué)指標(biāo)的檢測包括常規(guī)的骨長度、直徑和厚度等，還有骨彈性極限載荷、斷裂載荷和剛度等指標(biāo)[22]。而長骨干中段三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)也越來越多地被運(yùn)用，該試驗(yàn)反映骨結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)主要有最大載荷、最大橈度、扭力矩、彈性載荷、彈性橈度及能量吸收等。這些檢測反映骨生物力學(xué)強(qiáng)度的變化，可以輔助評(píng)價(jià)發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)。

5 小結(jié)

建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型在研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制、探討防治措施和新藥研究中均占有十分重要的地位，而去勢雌性大鼠動(dòng)物模型作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)典的研究材料，已被大多數(shù)學(xué)者所接受并廣泛運(yùn)用。本文就近年去勢雌性大鼠的制模方法、月齡選擇及檢測指標(biāo)作一綜述。值得關(guān)注的是我們對(duì)理想模型的要求是它的病變過程、病理改變及演變轉(zhuǎn)歸盡可能與人類骨質(zhì)疏松癥的變化相似，但不可否認(rèn)大鼠承載應(yīng)力與人類不同，骨骼生長狀況也因此與人類不盡相同。并且受體型的限制，血量少，不能多次取骨活檢標(biāo)本和大量采血標(biāo)本，而且藥代動(dòng)力學(xué)也與人類不同。受上述各種限制，大鼠去勢模型只可作為藥物效果的初步研究和OP的病理機(jī)制的初步探索，如果要做進(jìn)一步藥物療效的研究和模擬人類OP的探索，還需在其他種類的動(dòng)物模型上探討。

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1003—6350（2013）03—0424—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.03.0187

2012-09-11）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2010B031600288）

王鍵。E-mail：wangjian1911@126.com