蔣 勇，周 蓓，黎曉敏

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715）

牛支原體（Mb）是一類沒(méi)有細(xì)胞壁、介于細(xì)菌和病毒之間、能進(jìn)行自我復(fù)制、獨(dú)立生活的簡(jiǎn)單和極微小的原核微生物，是引起牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、流產(chǎn)與不孕等多種疾病的主要病原之一。牛支原體菌是在1961年首次從美國(guó)患乳腺炎病牛中分離獲得，而我國(guó)2008年首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，此后開始在我國(guó)蔓延[1-2]。由于牛感染牛支原體后的臨床癥狀和病理剖檢變化與傳染性胸膜肺炎非常相似，因而，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)于該病的準(zhǔn)確診斷具有重大意義。并且牛支原體繼發(fā)或混合感染其他病原體時(shí)，臨床癥狀加重，甚至死亡率增加。因此，有效預(yù)防控制和準(zhǔn)確診斷對(duì)于我國(guó)牛養(yǎng)殖業(yè)至關(guān)重要。

1 臨床診斷

感染牛支原體病的牛出現(xiàn)體溫升高、慢性咳嗽、氣喘、伴有清亮或膿性鼻汁。嚴(yán)重者食欲減退，被毛粗亂無(wú)光，生長(zhǎng)受阻，并出現(xiàn)糞水樣或帶血糞便。有的患牛繼發(fā)乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎，甚至出現(xiàn)流產(chǎn)和不孕。該病發(fā)病率高，治療不當(dāng)或不治情況下死亡率增高，與其他細(xì)菌或病毒混合感染時(shí)造成牛支原體病臨床癥狀復(fù)雜化，而且有些感染牛出現(xiàn)隱性感染，不表現(xiàn)出臨床癥狀[2]。因此，通過(guò)臨床癥狀只能懷疑感染牛支原體病而不能作出準(zhǔn)確判定。

2 病理學(xué)診斷

剖檢病理變化主要在肺臟和胸腔。有些病牛伴有不同程度的肺和胸膜黏連，并有少量積液。輕者可見(jiàn)肺尖葉、心葉及部分膈葉有局部紅色肉變，而且有些會(huì)出現(xiàn)化膿。嚴(yán)重者肺部多部位出現(xiàn)壞死灶，切開為干酪樣。

3 病原體檢測(cè)技術(shù)

3.1 病原分離培養(yǎng)

通過(guò)改進(jìn)分離培養(yǎng)基分離方法，按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)范操作接種病料于培養(yǎng)基上，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，牛支原體在固體培養(yǎng)基上具有典型的“煎蛋樣”圓形菌落特征，邊緣整齊，表面光滑，中間厚周邊薄，可見(jiàn)菌膜斑點(diǎn)；加入酚紅液體培養(yǎng)基中顏色由紅變黃，而且液體透亮。此分離方法從病變部位分離牛支原體分離率增高，但由于牛支原體分離培養(yǎng)難度大、穩(wěn)定性差、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低，還不能作為牛支原體感染快速診斷的方法。

3.2 免疫酶技術(shù)

酶聯(lián)免疫過(guò)氧化物（ELIP）和間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)用于檢測(cè)病肺中的牛支原體，克服了熒光抗體技術(shù)檢測(cè)慢性感染牛不敏感、需要新鮮樣本和熒光顯微鏡以及樣品不能長(zhǎng)期保存的缺點(diǎn)。用免疫酶技術(shù)檢查肺切片和涂片時(shí)，支原體被染成淡紅褐色的多形態(tài)顆粒，反應(yīng)很穩(wěn)定。目前該方法在檢測(cè)豬、羊等支原體肺炎病時(shí)較常用，而用于牛支原體檢測(cè)只見(jiàn)有少量相關(guān)報(bào)道。

3.3 免疫組化技術(shù)

免疫組化是一種特異性強(qiáng)、敏感度高的病原鑒定方法。該方法可以檢測(cè)到牛支原體抗原在機(jī)體的分布狀態(tài)，分離培養(yǎng)表明，牛支原體存在但病原培養(yǎng)又為陰性時(shí)，免疫組化技術(shù)就可以輔助分離培養(yǎng)定性鑒定牛支原體的存在。在干酪樣壞死性支氣管肺炎中，免疫組化顯示牛支原體抗原廣泛分布于壞死灶周圍；抗原主要存在于巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)，同時(shí)也存在于肺泡和支氣管腔內(nèi)的各種白細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞內(nèi)。雖然免疫組化法特異性強(qiáng)，敏感度高，但只能針對(duì)局部小塊病變組織，如果病灶選擇偏差或病情輕微時(shí)，免疫組化將很難檢測(cè)到病原體。

4 免疫印跡法

免疫印跡是以免疫覆蓋液為檢測(cè)探針，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行印跡分析的通稱。蛋白質(zhì)印跡中由于引進(jìn)了血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，使結(jié)果的分析更加準(zhǔn)確、細(xì)致。Thomas等通過(guò)對(duì)分離菌株表面膜蛋白分析，發(fā)現(xiàn)所有分離菌株Vsp蛋白表達(dá)具有高度的差異性[3]。Ghadersohi等通過(guò)將無(wú)乳支原體、牛生殖道支原體、精氨酸支原體以及牛支原體全細(xì)胞膜蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)牛支原體具有獨(dú)一無(wú)二的單克隆E4蛋白[4]。

5 核酸診斷技術(shù)

從牛支原體DNA中準(zhǔn)備一個(gè)SauⅢA消化的基因組庫(kù)，克隆到pUC19，再用準(zhǔn)備好的純化牛支原體DNA探針克隆雜交確定雜交的程度[6]。牛支原體的DNA片段就從EcoRⅠ和HindⅢ消化的重組質(zhì)粒中重新取回。而這種從牛支原體、無(wú)乳支原體、牛生殖道支原體、羊肺炎支原體以及不同種屬的精氨酸支原體中取出的固定化DNA可以隨意用來(lái)進(jìn)行引物探針斑點(diǎn)雜交分析。除牛支原體和羊肺炎支原體DNA外，其他都被發(fā)現(xiàn)有雜交跡象。此方法敏感性高、特異性強(qiáng)，但需進(jìn)一步結(jié)合PCR作出準(zhǔn)確的結(jié)果判定。

6 PCR診斷技術(shù)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）診斷鑒定方法可縮短牛支原體的鑒定時(shí)間，解決牛支原體培養(yǎng)和鑒定難、費(fèi)時(shí)的難題，使牛支原體在實(shí)驗(yàn)室診斷鑒定中顯得更加準(zhǔn)確、方便、快捷。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)牛支原體PCR診斷鑒定研究眾多，除普通PCR外，套式PCR、多重PCR、巢式PCR、RT-PCR等鑒別技術(shù)也是PCR診斷技術(shù)的研究重點(diǎn)。

基于牛支原體和牛無(wú)乳支原體16S rRNA同源性高的特點(diǎn)，Subramaniam等、Bashiruddin等分別使用UvrC基因特異序列和牛支原體oppD/F基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增[5-6]。而李媛等基于oppD/F基因序列對(duì)引物進(jìn)行改良，建立了牛支原體套式PCR檢測(cè)技術(shù)，提高了PCR方法敏感性，避免了非特異性的產(chǎn)生[7]。李大偉等根據(jù)牛支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆和無(wú)乳支原體3種病原的基因組序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物建立三重PCR方法，與牛支原體分離培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果一致，但敏感性低于單一PCR[8]。Foddai等基于牛支原體p81基因序列設(shè)計(jì)建立了多重PCR和PCR-RFLP診斷技術(shù)，成功鑒別牛支原體和無(wú)乳支原體，而且特異性更強(qiáng)，靈敏度更高[9]。此外，Pinnow等建立了特異的巢式PCR鑒定方法，該方法可以鑒定用防腐劑處理過(guò)的牛奶樣品[10]。Thomas等通過(guò)對(duì)20株牛支原體uvrC基因測(cè)序，并利用PCR擴(kuò)增到92株，證明了uvrC基因是PCR診斷牛支原體的保守序列[11]。

7 血清學(xué)抗體檢測(cè)技術(shù)

目前可用于牛支原體的血清學(xué)試驗(yàn)有血球吸附試驗(yàn)、放射免疫擴(kuò)散測(cè)定、沉淀反應(yīng)試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，其中用全細(xì)胞或抗原處理的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELI?SA）是現(xiàn)在最為有效的檢測(cè)方法。

ELISA主要用于牛支原體感染的血清學(xué)流行病評(píng)估及其暴發(fā)流行檢測(cè)，同時(shí)也用于檢查牛群感染狀態(tài)的檢測(cè)。在歐洲以及北美已普遍用于牛奶中抗M.bovis抗體診斷檢測(cè)，這使得檢測(cè)M.bovis的感染部位成為可能，其有效性和敏感性比傳統(tǒng)鑒定方法有所提高。Byrne等采用間接ELISA對(duì)奶牛場(chǎng)乳腺炎牛支原體感染及牛支原體組織樣品濾過(guò)液進(jìn)行病原學(xué)調(diào)查[12]。制備牛支原體特異性單克隆抗體，并建立一個(gè)夾心ELISA方法來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)基中是否有牛支原體抗原存在，目前已經(jīng)成為商品化診斷產(chǎn)品。此外，其他ELISA方法也可以用于建立識(shí)別抗M.bovis特異蛋白抗體，如利用重組Vsp蛋白或無(wú)乳支原體P48蛋白的同源物——膜脂蛋白作為目標(biāo)抗原[12]。有研究表明，P48蛋白抗血清能識(shí)別所有待檢的牛支原體，同時(shí)不與牛群中其他的同型支原體交叉反應(yīng)，說(shuō)明應(yīng)用P48蛋白建立的ELISA實(shí)驗(yàn)?zāi)苡糜贛.bovis感染的一種特異性標(biāo)記。并且利用VspA重組蛋白作為包被抗原建立ELISA的檢測(cè)方法可檢出自然感染和試驗(yàn)感染動(dòng)物血清中的特異抗體。目前，比利時(shí)、美國(guó)、加拿大、瑞士等國(guó)已經(jīng)成功生產(chǎn)出商品化的牛支原體血清抗體檢測(cè)試劑盒。而在我國(guó)，由于牛支原體研究起步晚，市場(chǎng)上雖有商品化的牛支原體血清抗體檢測(cè)試劑盒，但是檢測(cè)靈敏度以及精確性有待進(jìn)一步提高。

8 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)是傳統(tǒng)養(yǎng)殖大國(guó)，牛、羊養(yǎng)殖對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展起著重要作用，牛支原體病嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)健康快速發(fā)展。探索高效、快速、特異的檢測(cè)手段對(duì)于牛支原體疾病的診斷和治療具有十分重要的意義。近年來(lái)，牛支原體病引起我國(guó)學(xué)者廣泛關(guān)注與重視，然而，現(xiàn)階段我國(guó)對(duì)于牛支原體的研究尚處于起步階段，因此需要深入研究牛支原體的免疫機(jī)制、流行病學(xué)、致病機(jī)理，開發(fā)有效疫苗和疾病診斷試劑盒，有效防控牛支原體病，保障養(yǎng)牛業(yè)的健康快速發(fā)展。

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