白 順，孫建霞，鄒飛雁，孫叢龍，白衛(wèi)濱

(1.暨南大學(xué)發(fā)育與再生生物學(xué)系，廣東廣州510632;2.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006;3.暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，廣東廣州510632;4.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632)

食品生產(chǎn)、加工及儲(chǔ)存過程中當(dāng)氯離子與脂類經(jīng)過一系列條件反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生氯丙醇［1］，氯丙醇有多種同系物，其中3－氯－1，2－丙二醇(3－MCPD)因其染量和毒性較大，常作為氯丙醇研究的代表［2］。食品中的3－MCPD最初是在酸水解植物蛋白加工醬油等加工過程中發(fā)現(xiàn)，隨后相繼在方便面、面包、餅干、烤奶酪等熱加工的谷類食品中發(fā)現(xiàn)［3］。研究發(fā)現(xiàn)吸煙也能產(chǎn)生含量可觀的3－MCPD［4］。除此之外，精制油的過程中可產(chǎn)生大量的3－MCPD脂，3－MCPD脂會(huì)在體內(nèi)通過代謝途徑產(chǎn)生3－MCPD［5］。世界各地近年來逐漸開始重點(diǎn)關(guān)注氯丙醇。2001年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)(JECFA)對(duì)3－MCPD進(jìn)行安全評(píng)估，確定其暫定每日膳食耐受量(PMTDI)為2μg/kg，并于2006年再次評(píng)估這種污染物［6］。食品法典委員會(huì)(CAC)自2000年起討論氯丙醇，并于2008年設(shè)定含有酸水解植物蛋白的液態(tài)調(diào)味品(不包括天然發(fā)酵醬油)中3－MCPD的限量為 0.4mg/kg［7］。與此同時(shí)，歐洲委員會(huì)的成員國在不斷收集不同食物氯丙醇含量數(shù)據(jù)，并估計(jì)從食物中攝取氯丙醇的情況［8］。我國也于2010年食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(征求意見稿)中說明，通過食品污染物監(jiān)測網(wǎng)、國家總膳食研究及相關(guān)研究，確定3－MCPD主要來源，結(jié)合食品中3－MCPD污染的現(xiàn)狀和居民膳食3－MCPD暴露評(píng)估結(jié)果，提出僅限添加酸水解植物蛋白的液體調(diào)味品中3－MCPD的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.4mg/kg［9］。3－MCPD已被證明具有致突變性、致癌性和生殖遺傳毒性等，靶器官主要為腎臟和雄性生殖系統(tǒng)。本文介紹了其毒性的研究進(jìn)展。

1 3－MCPD體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)研究

Jones等［10］通過對(duì)雄性 Wistar大鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)來研究3－MCPD動(dòng)力學(xué)。雄性Wistar大鼠經(jīng)腹腔注射含14C標(biāo)記的3－MCPD(100mg/kg·d)后，大約30%的3－MCPD會(huì)以CO2形式呼出，23%氧化生成β－氯代乳酸，8.5%在給藥24h后以原形排除體外。此外研究發(fā)現(xiàn)，3－MCPD廣泛分布在體液中，并可通過血腦屏障和血睪屏障［11］。3－MCPD在體內(nèi)主要有兩種代謝途徑:一種能夠與谷胱甘肽結(jié)合后可解除毒性，其后形成草酸鹽［12］。有足夠證據(jù)顯示該代謝途徑可能會(huì)進(jìn)行微生物酶反應(yīng)形成縮水甘油［13］，而縮水甘油在體外和體內(nèi)的測試均顯示有基因毒性;另一種基于體外的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3－MCPD在哺乳動(dòng)物體內(nèi)可代謝為β－氯代乳酸，β－氯代乳酸能夠抑制生殖系統(tǒng)正常代謝，隨后β－氯代乳酸會(huì)進(jìn)一步分解成CO2和草酸鹽［10］。一般通過檢測尿道排出的代謝物 β－氯代乳酸來檢測體內(nèi)的 3－MCPD含量［14］。

2 3－MCPD毒性作用

2.1 急性毒性

在小鼠和大鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，腎臟最容易受到3－MCPD毒性的影響，是3－MCPD的靶器官。給予SD大鼠及Wistar小鼠腹腔注射濃度為100mg/kg·d的3－MCPD一段時(shí)間后，觀察到SD雄鼠出現(xiàn)急性腎小球腎炎，Wsitar雄鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的糖尿和蛋白尿［10，15］。小鼠灌胃攝入濃度為 30mg/kg·d的3－MCPD 4周或大鼠口服濃度為9mg/kg·d的3－MCPD 13周后，腎臟的重量顯著增加［16］。雄性和雌性小鼠分別灌胃給予37、30mg/kg·d的3－MCPD 13周后，腎臟的重量增加且雄性小鼠的生精上皮明顯呈惡化狀態(tài)［17］。最近的一項(xiàng)研究結(jié)果表明，喂食溶解在玉米油中3－MCPD，所有實(shí)驗(yàn)組均有一定劑量依賴的正常色素貧血，1～5周后高劑量下會(huì)導(dǎo)致一半的雌性大鼠死于腎衰竭［14］。雄性和雌性小鼠無明顯副作用劑量(NOAEL)分別為 18 和 15mg/kg·d［17］。

3－MCPD的腎臟毒理機(jī)制是由于3－MCPD代謝β－氯代乳酸的過程中抑制了糖酵解的代謝過程［18］。糖酵解產(chǎn)能的過程受到破壞可導(dǎo)致腎毒性作用。此外，腎臟中3－MCPD代謝草酸鹽的增加也可以導(dǎo)致其毒性損傷作用［19］。還有研究中表明，給予大鼠劑量為30mg/kg·d的3－MCPD 40d后，發(fā)現(xiàn)尿中半乳糖基甘油的含量是3－MCPD影響機(jī)體的一個(gè)早期生物標(biāo)記物。由此猜測3－MCPD使腎和附睪中β－半乳糖(一種溶酶體酶)失衡，導(dǎo)致半乳糖基甘油水解為半乳糖和甘油［20］。

靈長類急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3－MCPD對(duì)骨髓有毒性作用［21］。6只雄性恒河猴口服給予劑量為30mg/kg·d的3－MCPD，其中三只在1～5周均表現(xiàn)出腦出血、抑郁、體弱的臨床癥狀，通過血液學(xué)深入研究表明其體內(nèi)出現(xiàn)貧血、白細(xì)胞減少以及嚴(yán)重的血小板減少現(xiàn)象，呈現(xiàn)典型的骨髓損傷現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)過程中，有2只猴子死于骨髓病，證明3－MCPD對(duì)靈長類動(dòng)物骨髓的毒性作用明顯。但目前3－MCPD在靈長類毒理作用的機(jī)制還沒有進(jìn)一步的深入研究，對(duì)腎的影響還未見相關(guān)報(bào)道。

2.2 致癌性

體外研究Swiss小鼠皮下和腹腔注射3－MCPD［22］以 及 SD［23］、Fiseher344［24］、B6C3F1［25］大 鼠 喂 食 含3－MCPD食物的實(shí)驗(yàn)確定3－MCPD具有致癌性。然而，只有3次實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是完全按照OECD致癌性實(shí)驗(yàn)451指導(dǎo)的［26］。因此，對(duì)于口服3－MCPD致癌性的劑量還值得進(jìn)一步研究確定。

Sunahara 等［24］研究了雄性和雌性 Fischer F344大鼠給予含3－MCPD的飲用水2年(20，100和500ppm)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雄性劑量在 1.1、5.2、28.3mg/kg·d或雌性劑量在35.3mg/kg·d時(shí)，3－MCPD有致癌性，而且所有實(shí)驗(yàn)組腎小管畸形率均高于對(duì)照組，高劑量組(100、500ppm)有明顯的腎毒性。此外，3－MCPD實(shí)驗(yàn)組可增加腎臟和睪丸間質(zhì)細(xì)胞腫瘤發(fā)生幾率，具有劑量依賴性，但由于引起腎小管畸形的劑量比它低，所以可以算是二次作用的結(jié)果。同時(shí)，3－MCPD的刺激可引起雄性乳腺癌和包皮腺腫瘤升高，這可能是由于大量間質(zhì)瘤細(xì)胞激素刺激作用的結(jié)果。

Cho等［23］對(duì)SD大鼠兩年的致癌性研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雄鼠或雌鼠喂食3－MCPD 劑量為2.0、8.27、29.5mg/kg·d和2.7、10.3、37mg/kg·d時(shí)，雖然所有劑量刺激的雄性睪丸輸精管以及動(dòng)脈外膜等都沒有腫瘤的發(fā)生，但腎小管腫瘤的發(fā)生率呈明顯上升趨勢。雄性所有實(shí)驗(yàn)組的腎小管致癌性和雌性400ppm組腎小管瘤都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)劑量達(dá)到400ppm時(shí)，SD大鼠間質(zhì)細(xì)胞腫瘤顯著增加，而乳腺癌卻沒有明顯變化，提示了前人研究的Fischer344大鼠乳腺癌發(fā)生可能是一個(gè)特殊的現(xiàn)象。對(duì)兩個(gè)不同品系的大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)得出腎小管畸形和慢性腎病發(fā)生率上升會(huì)伴隨腎小管瘤的產(chǎn)生，即3－MCPD刺激的腎瘤是由于腎小管畸形和慢性病造成的。

然而，最新對(duì)B6C3F1小鼠2年致癌性研究與上述結(jié)果卻剛好相反［25］。通過飲水給予3－MCPD劑量為30、100、300ppm時(shí)沒有產(chǎn)生任何腫瘤，也沒有結(jié)果顯示3－MCPD對(duì)腎或其他生殖器官造成損傷。以上這些結(jié)果可能是3－MCPD種屬差異毒性造成的，對(duì)于3－MCPD致癌性的研究還需要更多機(jī)制方面的研究。

2.3 遺傳毒性

3－MCPD在外源性代謝活性系統(tǒng)存在或不存在時(shí)，細(xì)菌基因突變測試結(jié)果均顯示為陽性［27］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外遺傳毒性實(shí)驗(yàn)，包括小鼠淋巴瘤細(xì)胞Tk基因處的突變測試、V79細(xì)胞hprt基因處突變和姐妹染色單體互換測試等，均呈現(xiàn)基因毒性結(jié)果［28－30］。雖然，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明 3－MCPD 具有遺傳毒性，但是在所有體內(nèi)3－MCPD基因毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，包括果蠅突變/重組實(shí)驗(yàn)、大鼠程序外DNA合成、小鼠骨髓微核測試、大鼠體內(nèi)腎臟和睪丸組織細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)等，都是陰性結(jié)果［31－35］。

早期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能誘導(dǎo)3－MCPD脫氯代謝為一個(gè)已知的鼠傷寒菌突變劑縮水甘油［31］，因此在細(xì)胞的遺傳毒性測試結(jié)果為陽性。而在哺乳動(dòng)物中3－MCPD代謝為縮水甘油的含量很少，所以在體內(nèi)就沒有基因毒性。由此說明3－MCPD遺傳毒性的結(jié)果在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物中是有兩種不同的作用機(jī)制。

2.4 生殖毒性

多年以前，3－MCPD被認(rèn)為作為一個(gè)潛在的男性避孕藥，因?yàn)樗苎杆倏赡娴呐c成熟精子作用，抑制精子活性。后來在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)靈長類有副作用現(xiàn)象［36］，此種避孕藥的研究就此終止。一些生殖毒性實(shí)驗(yàn)表明3－MCPD對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有毒性作用［37－40］。給予大鼠濃度為 1mg/kg·d 的 3－MCPD時(shí)，大鼠的精子運(yùn)動(dòng)能力顯著降低，雄性生殖能力受損。當(dāng)劑量大于10～20mg/kg·d時(shí)，大鼠精子形態(tài)改變，附睪受損。受3－MCPD刺激的其他哺乳動(dòng)物(包括倉鼠、豚鼠、狗、羊、恒河猴)也能降低生育力，但刺激劑量稍高于大鼠。雖然具體的分子機(jī)制尚未得知，但通過一些研究發(fā)現(xiàn)精子活力降低或許是由于3－MCPD代謝物抑制了精子糖酵解中酶類活性［37］。3－MCPD 實(shí)驗(yàn)組 H+－ATP 酶表達(dá)量降低，隨后附睪尾pH改變，抑制精子形成及精子活性［38］。

李寧等［39］進(jìn)行3－MCPD對(duì)大鼠的生殖毒性作用研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)劑量達(dá)到8、16mg/kg·d時(shí)，精子存活率和睪丸LDH－X顯著降低，睪丸和附睪出現(xiàn)病理改變，提示3－MCPD可能通過影響酶的活性干擾睪丸能量代謝和分裂過程而導(dǎo)致生殖毒性。Barocelli等［14］研究表明雄性大鼠在高劑量3－MCPD刺激下存在睪丸毒性，并有顯著細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。中劑量有一定的睪丸損傷，凋亡因子Caspase 3活性上升，但一些跟氧化壓力相關(guān)的標(biāo)志物含量沒有變化(硫代巴比妥酸還原值TBARS和碳基化合物)。

Ramy等［40］對(duì)交配11.5d后的孕鼠給予劑量為5，10或25mg/kg·d的3－MCPD 1周后，發(fā)現(xiàn)中高劑量組孕鼠的體重明顯降低，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)胚胎組織中含有3－MCPD以及其代謝產(chǎn)物β－氯代乳酸，但孕鼠的睪酮分泌量以及睪丸關(guān)鍵基因表達(dá)都沒有明顯改變，說明3－MCPD對(duì)睪丸器官形成沒有影響。

綜合以上生殖毒性結(jié)果，研究睪丸內(nèi)相關(guān)細(xì)胞凋亡是闡明其生殖毒性的重點(diǎn)研究方向，揭示生殖細(xì)胞的凋亡通路和機(jī)制是未來重點(diǎn)研究內(nèi)容。

2.5 免疫毒性

對(duì)3－MCPD及其代謝物的免疫毒性研究中發(fā)現(xiàn)其能抑制脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能［41－44］。雌性小鼠喂食含 0、25、50、100mg/kg·d 3－MCPD 14d，觀察得到3－MCPD對(duì)小鼠的免疫系統(tǒng)中的臟器沒有相關(guān)病理學(xué)的改變，但在高劑量組小鼠脾臟重量顯著下降，脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞數(shù)量所占的比例明顯下降，抗體合成量也顯著降低。自然殺傷(NK)細(xì)胞活性在50和100mg/kg·d組下降明顯［41］?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)和延遲性超敏反應(yīng)沒有明顯的變化。但CD4+CD8+細(xì)胞明顯減少，腹腔巨噬細(xì)胞活力明顯不如對(duì)照組［42］。Byun 等［43］發(fā)現(xiàn) 3－MCPD 濃度在 2～8mmol/L時(shí)，刀豆蛋白A(ConA)、抗CD3+和脂多糖(LPS)刺激的淋巴細(xì)胞活性下降，而LPS更可在3－MCPD濃度為0.2～2mmol/L時(shí)促使淋巴細(xì)胞增殖能力降低。與ConA共培養(yǎng)的脾細(xì)胞在3－MCPD刺激劑量為1、2或4mmol/L以上時(shí)，脾細(xì)胞內(nèi)干擾素(IFN－γ)、白介素IL10以及白介素IL4水平明顯降低。當(dāng)3－MCPD劑量在0.5mmol/L時(shí)，可以抑制腫瘤壞死因子TNF－α的激活。3－MCPD代謝產(chǎn)物 β－氯代乳酸濃度在200～800μmol/L之間時(shí)，ConA、抗 CD3+和 LPS 刺激的脾細(xì)胞與對(duì)照組相比活性均呈下降趨勢。與ConA共培養(yǎng)的脾細(xì)胞，當(dāng)β－氯代乳酸刺激濃度大于100μmmol/L時(shí)，IFN－g、IL－2和 IL－4 表達(dá)均下調(diào)［44］。

2.6 神經(jīng)毒性

研究表明3－MCPD對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有毒性作用，90mg/kg·d劑量能導(dǎo)致小鼠四肢麻木。攝入3－MCPD可大范圍分布在身體內(nèi)，穿過血腦屏障［11］。但Kim等［45］對(duì)10只SD雄、雌鼠分別口服11周濃度為0、10、20 或30mg/kg·d的3－MCPD 研究中，觀察到高劑量刺激的雄鼠體重顯著降低，而所有實(shí)驗(yàn)組大鼠活動(dòng)能力、著陸能力、前足握力都沒有顯著的影響。結(jié)果表明3－MCPD在該劑量下沒有表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。隨后，Kim 等［46］又研究了 3－MCPD(10和30mg/kg·d)喂食13周對(duì)SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)中一氧化氮合酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在大鼠前囪后1.0mm處，實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)和紋狀體的神經(jīng)元一氧化氮合酶(nNOS)表達(dá)量顯著下調(diào)，而在前2.3mm處，nNOS與對(duì)照組相比沒有顯著差異。實(shí)驗(yàn)組新皮質(zhì)和紋狀體的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)在前囪前2.3、0.4和后1.1mm處表達(dá)均降低。這些數(shù)據(jù)表明3－MCPD代償性調(diào)節(jié)新皮質(zhì)和紋狀體處的nNOS和iNOS表達(dá)。當(dāng)一氧化氮(NO)合成通路中的關(guān)鍵酶失調(diào)時(shí)會(huì)導(dǎo)致NO神經(jīng)傳遞過程受損，這是大腦機(jī)能障礙的起因，可引起神經(jīng)毒性。

Skamarauskas等［47］對(duì) 3－MCPD 的神經(jīng)毒性機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，3－MCPD不會(huì)通過影響大腦內(nèi)能量的合成表現(xiàn)出神經(jīng)毒性，可能是通過選擇性的破壞體內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡引起的毒性作用。

3 3－MCPD基準(zhǔn)劑量

長期暴露的劑量一般是以無明顯毒害作用水平(NOAEL)為基礎(chǔ)的?；鶞?zhǔn)劑量(BMD)最初由Crump于1982年提出，用于評(píng)價(jià)關(guān)鍵性的致毒臨界點(diǎn)。Hwang等研究用 BMD替代 NOAEL來改進(jìn)當(dāng)前3－MCPD的危險(xiǎn)評(píng)估。通過美國環(huán)保局USEPA的BMD軟件綜合分析3－MCPD刺激大鼠腎小管增生確定3－MCPD 10%的 BMD10和最低基準(zhǔn)劑量(BMDL10)分別為 0.94、0.68mg/kg·d，其 BMDL 的值比NOAEL要稍高一些，但沒有最低可見有害作用水平(LOAEL)高。這些值對(duì)確定3－MCPD每天最大忍受劑量(TDI)能夠起到關(guān)鍵性的決定。此次研究證明BMD在食品污染物危險(xiǎn)評(píng)估的含量測定中是非常有用的一個(gè)指標(biāo)［48］。

Barocelli等研究發(fā)現(xiàn)雄性3－MCPD對(duì)腎和睪丸結(jié)構(gòu)基本損傷劑量(BMD10)分別為5.6、8.4mg/kg·d，BMDL10為 2.5、6.0mg/kg·d，雌性 BMD10和 BMDL10致死量為 7.4、2.3mg/kg·d［14］。Cho 等［23］在兩年的 3－MCPD毒性研究結(jié)果分析中運(yùn)用了BMD。通過軟件估算得出雄鼠受3－MCPD刺激2年的腎小管增生BMDL10為 0.87mg/kg·d，雌性為 19.47mg/kg·d。基于這些結(jié)果作者認(rèn)為，人類3－MCPD最大忍受劑量(TDI)可參照雄性大鼠BMDL10的值即0.87mg/kg·d。Rietjens等［49］認(rèn)為 BMD 是3－MCPD 引起大鼠腎小管增生最敏感的值。通過其他研究學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)得出BMDL10值在所有大鼠模型組中均值為0.72mg/kg·d?；贐MDL10并考慮到種間的差別，推斷人類的TDI為7μg/kg·d。

一直以來，國際食品科學(xué)委員會(huì)(SCF)［31］和食品添加劑委員會(huì)(JECFA)［6］都是通過LOAEL值推導(dǎo)出TDI，但在2009年歐洲食品安全局(EFSA)卻發(fā)布使用基準(zhǔn)劑量(BMD)用于毒物的危險(xiǎn)評(píng)估［50］，具體的說明如下:在一些研究中，需要有與對(duì)照組相比最低可見有害作用水平(LOAEL)的作用。在無顯著有害作用水平(NOAEL)上，一般要把LOAEL去除一個(gè)額外的不確定因素。然而，在BMD劑量上，最低基準(zhǔn)劑量BMDL是建立在基準(zhǔn)反應(yīng)(BMR)的數(shù)據(jù)上確定的，并不需要其他額外的不確定因素。

4 展望

目前為止，關(guān)于3－MCPD毒理作用的研究盡管取得了一定的研究成果，但這些結(jié)果仍不能滿足3－MCPD毒理評(píng)價(jià)需要。今后關(guān)于3－MCPD毒性的研究在以下幾個(gè)方面需進(jìn)行深入的研究:3－MCPD毒理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)建及確認(rèn);3－MCPD毒性作用的分子機(jī)制;人體3－MCPD暴露數(shù)據(jù)及最低安全劑量;3－MCPD毒性發(fā)生后的解毒措施及機(jī)制。相信隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)和研究的深入，3－MCPD毒理機(jī)制的研究將會(huì)取得進(jìn)一步的突破，為人類預(yù)防和解除3－MCPD毒性提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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