弓軍勝，馮瑞錚，余睿芳(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院整形科，太原 030001;通訊作者，E-mail:frz1121@sina.com)

瘢痕的形成與成纖維細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor-beta，TGF-β)信號(hào)關(guān)系密切［1］。TGF-β/Smads信號(hào)通路異?；罨?，能有效地刺激瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、合成和分泌大量Ⅰ、Ⅲ型膠原，最后導(dǎo)致瘢痕的形成。TGF-β誘導(dǎo)早期基因(TGF-β inducible early gene，TIEG)能夠模擬 TGF-β/Smads信號(hào)通路的生物學(xué)效應(yīng)，增強(qiáng)TGF-β/Smads的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用，并且發(fā)現(xiàn)TIEG增強(qiáng)Smads信號(hào)通路的作用是通過上調(diào)Smad2基因轉(zhuǎn)錄，抑制Smad7啟動(dòng)子附近特殊的反應(yīng)元件實(shí)現(xiàn)的［2］。

本課題將通過對(duì)正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)其TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路中有關(guān)傳導(dǎo)分子 mRNA(如 TIEG、Smad2、Smad7)的表達(dá)情況進(jìn)行比較，并探討相關(guān)意義，為今后臨床應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

瘢痕疙瘩標(biāo)本取自我院就診治療的患者50例。無結(jié)締組織、心、肝、腎、肺等疾患，6個(gè)月內(nèi)未使用類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物等，且未曾接受放療。將標(biāo)本漂洗數(shù)次，分別去除上皮，分別切成5塊2 mm×2 mm大小的組織塊，送入無菌培養(yǎng)瓶中，加入RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，另加5 ml培養(yǎng)液及少量胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。每3-4 d換液一次。待培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，PBS漂洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)［3］。取第5代之內(nèi)的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞總RNA的提取 分別取瘢痕疙瘩與正常皮膚組織的細(xì)胞共100例，并將其按Tripure Reagent總RNA分離試劑盒說明進(jìn)行提取RNA。

1.2.2 提取的總RNA的濃度、純度測(cè)定和完整性分析 用紫外分光光度儀分別測(cè)定在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD260和OD280)，通過以下公式計(jì)算RNA的濃度:RNA(μg/μl)=OD260×40/1 000×稀釋倍數(shù)，同時(shí)計(jì)算 OD260和 OD280的比值(OD260/OD280)，當(dāng)比值接近于2.0時(shí)，說明提取的RNA較純，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，-70℃保存。利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性的鑒定。

1.2.3 RT-PCR 用總RNA制備cDNA:在2 5 μl反應(yīng)體系中包括1 μg 待檢總 RNA，2 μl Oligo(dT)，5 μl AMV Buffer，5 μl 三 磷 酸 脫 氧 核 糖 核 苷(dNTP)，0.5 μl RNA 酶抑制物，l μl禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶，0.1%焦碳酸二乙酶(DEPC)水13.5 μl，42 ℃水浴1 h 后，5 ℃ 5 min 破壞反轉(zhuǎn)錄酶終止反應(yīng)。冰浴5 min后-70℃保存。

PCR擴(kuò)增β-actin以及各個(gè)目的基因:在50 μl反應(yīng)體系中包括 2 μl cDNA，5 μl 10 ×Taq Buffer，上游引物、下游引物各 1 μl，4 μl 25 mmol/L MgCl2，8 μl dNTP 的混合物，濃度為 2.5 mmol/L，1 μl Ex Taq DNA 酶(5 U/μl)，28 μl去離子水。具體引物序列見表1。

表1 有關(guān)傳導(dǎo)分子引物序列Table 1 Sequencing of primers

PCR反應(yīng)條件如下:94℃ 5 min預(yù)變性，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，94℃ 1 min變性，52-58℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，最后72℃ 10 min充分延伸。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物電泳鑒定，以明確擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)目和大小。

1.2.4 電泳條帶的光密度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)各電泳條帶的光密度定量分析，RT-PCR產(chǎn)物以各組細(xì)胞的目的基因與β-actin的光密度比值進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

用Tripure提取成纖維細(xì)胞總RNA，用變性的甲醛電泳證實(shí)了所提取的總RNA的比值約為2∶1，圖1中可見其中6個(gè)樣本清晰的28 s、18 s和5 s三條帶，而且28 s與18 s的比值約為2∶1，表明提取的RNA結(jié)構(gòu)完好，無降解。

圖1 成纖維細(xì)胞提取的RNA凝膠電泳圖(從左至右依次為6個(gè)樣本的電泳帶)Figure 1 Gel electrophoresis of extracted RNA in keloid fibroblasts

采用RT-PCR法，從成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的基因cDNA片段。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞組TIEG、Smad2 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞組，而Smad7 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常皮膚成纖維細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2及圖2)。

表2 瘢痕疙瘩組與正常皮膚組成纖維細(xì)胞中各基因mRNA表達(dá)水平 (n=100)Table 2 The mRNA levels of TIEG，Smad2，Smad7 in fibroblasts of keloid tissues and normal controls(n=100)

3 討論

創(chuàng)傷愈合時(shí)過度的組織纖維化導(dǎo)致瘢痕疙瘩形成，在此過程中TGF-β與受體的過度表達(dá)是一個(gè)關(guān)鍵的因素。TGF-β分泌活躍的細(xì)胞出現(xiàn)在傷口部位時(shí)，可以通過自分泌和旁分泌作用來加強(qiáng)其致纖維化的作用。

TGF-β/Smads信號(hào)通路中 TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)主要通過細(xì)胞內(nèi)的 Smad蛋白介導(dǎo)［4］，其中受體調(diào)節(jié)性Smads(Smad2，Smad3)起著正性調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)瘢痕的形成，抑制性Smad(Smad7)發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用［5］，抑制瘢痕的進(jìn)展。而TGF-β致纖維化的效應(yīng)主要是通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成，抑制ECM降解，最終導(dǎo)致ECM的積聚。

圖2 瘢痕疙瘩組與正常皮膚組成纖維細(xì)胞中各基因mRNA表達(dá)電泳圖Figure 2 The mRNA expression of TIEG，Smad2，Smad7 mRNA in fibroblasts of keloid tissues and normal controls by RTPCR

本研究顯示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，TIEG mRNA水平的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，可見TIEG以及TGF-β的過度表達(dá)與瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。進(jìn)一步又分析了Smad蛋白的表達(dá)，顯示瘢痕疙瘩中表達(dá)Smad2 mRNA增強(qiáng)，表達(dá)Smad7 mRNA減弱，說明 TIEG能夠模擬 TGF-β/Smads信號(hào)通路的生物學(xué)效應(yīng)并依賴于 Smad2，TIEG過度表達(dá)能下調(diào)內(nèi)源性Smad7并上調(diào)Smad2基因轉(zhuǎn)錄。

最新研究表明細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的基因啟動(dòng)子上存在Smads蛋白的結(jié)合位點(diǎn)［6］，一些參與細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控如CTGF、α-SMA、Smad7等的基因啟動(dòng)子上亦發(fā)現(xiàn)有 Smads蛋白的結(jié)合位點(diǎn)［25，26］。TGF-β可通過Smads信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)上述靶基因的表達(dá)，參與組織纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

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［3］ Gordon，Kelly J;Blobe，Gerard C.Role of transforming growth factor be to superfamily signaling pathways in human disease［J］.Biochim Biophys Acta，2008，4(1978):197

［4］ 繆澤群，宋韜.TGF-β1調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞分泌MMP-1及TIMP-1的研究［J］.中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2013，29(6):373-375.

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