范海玲，尹水貴，婁 普，任素偉，黃 勝，陳 翔

（1.溫州醫(yī)學(xué)院，2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江溫州325027）

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxia／ischemia brain damage，HIBD）是新生兒期危害最大的常見病，病死率高，且常遺留下腦癱，后者以中樞性運動障礙為特征，常伴隨有認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)功能缺陷，其在國內(nèi)外均有一定發(fā)病率且有增高趨勢，因其發(fā)病機理復(fù)雜，臨床治療棘手，因此尋找阻止腦損傷進程，增強腦組織修復(fù)的治療策略對HIBD患兒具有重要的臨床意義。腺苷是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護劑，近年來有關(guān)腺苷和腺苷受體A2A（adenosine A2Areceptor，A2AR）在成年鼠缺血性腦損傷中有神經(jīng)保護作用，研究發(fā)現(xiàn)A2AR拮抗劑可以對抗成年鼠缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡［1］，Li Wei等［2］發(fā)現(xiàn)敲除A2AR可以減少急性腦外傷受損引起的神經(jīng)元凋亡，因此A2AR可能在控制各種腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡方面起著重要的作用，然而相關(guān)的機制目前還不明確。c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路是絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的其中一條，與細胞凋亡密切相關(guān)［3］。然而在A2AR敲除新生小鼠HIBD模型中有關(guān)神經(jīng)細胞凋亡機制的研究尚未見報道。因此本實驗通過建立7日齡新生小鼠HIBD模型，模擬圍生期缺氧缺血性腦損傷的病理改變，進一步動態(tài)觀察HIBD后各時間點小鼠的神經(jīng)行為學(xué)和腦組織細胞形態(tài)學(xué)改變、神經(jīng)細胞凋亡以及P-JNK表達的變化，研究敲除A2AR對HIBD模型小鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡的影響并初步探討其可能的作用機制，為腺苷早期用于該類疾病引起的腦功能損害提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（美國Roche公司），P-JNK兔單克隆抗體（CST公司），DAB顯色試劑盒（美國ZYMED公司），RSS-51W型氧氣監(jiān)測儀CYES-II（德國LEICA公司），體式顯微鏡 ST60（寧波舜宇儀器有限公司），BX51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），Image ProPlus 6.0彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系（美國Media Cybernetics公司）等。

1.2 實驗動物及其分組

由美國波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子神經(jīng)藥理學(xué)研究所引進A2AR敲除雜合子小鼠，在溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心SPF級對引進的雜合子小鼠進行繁殖，根據(jù)基因型鑒定結(jié)果篩選A2AR敲除型（adenosine A2Areceptor knockout，A2ARKO）和 A2AR野生型（adenosine A2Areceptor wildtype，A2ARWT）小鼠供本實驗使用。新生小鼠7日齡，雌雄不限，共80只。分組如下：敲除型假手術(shù)組（sham knockout，SKO）與野生型假手術(shù)組（sham wildtype，SWT），敲除型模型組（model knockout，MKO）與野生型模型組（modelwildtype，MWT），模型組分1 d，3 d，7 d，共8小組。新生小鼠入選標(biāo)準(zhǔn)：體重（3±0.5）g，平面翻正反射成績高于正常值（2 s）兩倍或兩倍以上的小鼠要剔除。

1.3 新生小鼠HIBD模型的建立

參照經(jīng)典Rice-Vannucci法建立7日齡新生小鼠HIBD模型［4］。將小鼠仰臥固定于手術(shù)板上，4%水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉后，在解剖顯微鏡下行頸部正中切口，分離出左側(cè)頸總動脈，并用5-0號滅菌絲線遠近端雙線結(jié)扎，縫合傷口。整個手術(shù)過程在10 min內(nèi)完成。恢復(fù)2 h后將小鼠置于37℃的恒溫密閉缺氧瓶內(nèi)，并輸入8%氧氣和92%氮氣的混合氣體，缺氧1 h；缺氧結(jié)束后，將存活的小鼠返回母鼠身邊繼續(xù)哺乳喂養(yǎng)。假手術(shù)組：僅游離左頸總動脈但不結(jié)扎且無缺氧處理。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 短期神經(jīng)功能評定 實驗動物造模后1 d，檢測三種新生小鼠特殊的發(fā)育反射［5］：（1）翻正反射（righting reflex）：從小鼠仰臥位置開始計時，到小鼠自行翻身成俯臥位、前后爪放平計時停止；（2）趨地反射（geotaxis reflex）：將小鼠頭朝下置于傾斜度為40°斜坡上，記錄小鼠扭轉(zhuǎn)身體（90°）頭朝上所用的時間；（3）懸崖逃避反射（cliff aversion reflex）：將小鼠前爪懸于桌面邊緣之外，桌面離地1 m，記錄小鼠扭轉(zhuǎn)身體（90°）離開桌面邊緣所用的時間，若（2）和（3）項反射在20 s內(nèi)不能完成，則剔除。另一方面，觀察模型組小鼠是否出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈，若無，則剔除。

1.4.2 腦組織病理學(xué)檢測 到達規(guī)定時間點后，4%多聚甲醛經(jīng)心內(nèi)灌注固定腦組織，隨后切取含海馬的大腦組織塊置于4%多聚甲醛液中4℃固定24 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋。選取海馬齒狀回互相環(huán)抱平面連續(xù)冠狀切片，切片厚3～4μm，每隔5張取1張切片，每只小鼠取2張切片分別做HE染色和尼氏染色，在光鏡下觀察。

1.4.3 神經(jīng)細胞凋亡檢測 每只小鼠取1張石蠟切片用TUNEL染色，按說明書進行操作，DAB顯色，含棕褐色和棕黃色顆粒細胞為陽性（凋亡）細胞。每張切片用Olympus-BX51顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)采集缺血側(cè)海馬CA1區(qū)（×400倍）光鏡下5個不重疊視野，應(yīng)用美國IPP 6.0圖像分析軟件對凋亡細胞陽性表達的區(qū)域測量累積光密度值（integrated optical density，IOD）。

1.4.4 SP法免疫組化檢測缺血側(cè)海馬 CA1區(qū) PJNK陽性細胞的表達 簡要步驟如下：每只小鼠隨機選5張切片脫蠟，3%H2O2于37℃15～20 min滅活內(nèi)源性酶，PBS洗5 min×3次；微波修復(fù)抗原 10 min，降至室溫，PBS洗 5 min×3次；滴加 P-JNK（1∶100）單抗單抗工作液，4℃孵育過夜，復(fù)溫 45 min，PBS洗5min×3次；滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體二抗，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：缺血側(cè)海馬CA1區(qū)P-JNK陽性表達細胞為胞漿、胞核均可呈現(xiàn)棕黃色。每只動物隨機取免疫組化切片3張，Olympus-BX51顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)采集每張切片缺血側(cè)海馬 CA1區(qū)（×400倍）光鏡下5個不重疊視野，用美國IPP 6.0圖像分析軟件測量累積光密度值（integrated optical density，IOD），再計算其平均光密度值（IOD／area），即 P-JNK陽性細胞表達的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并進行正態(tài)性檢驗。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差（one-way ANOVA）分析，兩兩比較用 LSD-t檢驗，方差不齊的用 Dunnett’T3檢驗，兩變量的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 新生小鼠HIBD模型的評估

2.1.1 新生小鼠HIBD神經(jīng)行為學(xué)的改變 （1）造模過程中小鼠的行為學(xué)改變：缺氧約10 min，動物開始煩躁不安，缺氧15～20 min，出現(xiàn)呼吸加深加快，口唇發(fā)紺；約30 min大部分站立不穩(wěn)，偶有激惹現(xiàn)象；40～50min大部分小鼠活動明顯減少，平面翻正反射時間超過10 s，膚色蒼白發(fā)紺明顯；1 h時幾乎所有小鼠出現(xiàn)翻身不能、嗜睡。（2）短期神經(jīng)功能評定：實驗動物造模后1 d，模型組約80%的小鼠出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈，與基因型無關(guān)。通過檢測三種新生小鼠特殊的發(fā)育反射，結(jié)果表明S組小鼠均未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，M組小鼠完成翻正反射、趨地反射和懸崖逃避反射的時間明顯長于S組（P＜0.01），均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，并且M1dKO組完成上述反射的時間均長于M1dWT組（P＜0.01、P＜0.05），各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表 1）。

Tab.1 Effect of adenosine A2A receptor knockout（A2ARKO）on righting reflex and geotaxis reflex and cliff aversion reflex followed 1 day of newbornmice after hypoxia／ischemia brain damage（s，±s）

Tab.1 Effect of adenosine A2A receptor knockout（A2ARKO）on righting reflex and geotaxis reflex and cliff aversion reflex followed 1 day of newbornmice after hypoxia／ischemia brain damage（s，±s）

S：Sham；WT：Wildtype；KO：Knockout；M：Model*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sham group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs WT group

Group n Righting reflex Geotaxis reflex Cliff aversion reflex SWT 10 2.9000±0.7379 7.6000±0.7888 10.8000±1.1236 SKO 10 3.2000±0.6325 7.3000±0.2134 11.0000±1.0541 M1dWT 30 3.9667±0.5561** 13.6333±0.9353** 15.3667±0.8899**M1dKO 30 5.2000±0.6644**＃＃ 15.7667±0.3781**＃＃ 15.9667±1.3515**＃

2.1.2 新生小鼠HIBD腦組織細胞形態(tài)學(xué)變化即腦組織病理光鏡結(jié)果 （1）HE染色結(jié)果：S組大腦海馬CA1區(qū)細胞排列整齊，細胞間質(zhì)均勻，細胞結(jié)構(gòu)正常，未見神經(jīng)細胞變性壞死等明顯病理變化。M組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)模糊，組織間隙明顯增寬，細胞和間質(zhì)水腫較嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯空泡化；M1d組損傷最明顯。與MWT組比較，MKO組各時間點病理損傷均有不同程度的加重（圖1）。（2）尼氏染色結(jié)果：S組大腦海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，細胞形態(tài)正常，排列整齊，尼氏小體呈深藍色斑塊狀，分布量多。M組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)模糊，細胞數(shù)減少，排列稀疏，細胞腫脹，甚至尼氏小體出現(xiàn)溶解、空泡化，尼氏小體大量脫失；M1d組損傷最明顯。與MWT組比較，MKO組各時間點細胞的腫脹及空泡化較明顯，尼氏小體的丟失量更多（圖2）。

2.1.3 TUNEL染色檢測凋亡神經(jīng)細胞結(jié)果 S組腦組織海馬CA1區(qū)有少許的凋亡細胞，而SKO組和SWT組無顯著性差異（P＞0.05）。與 S組比較，M組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)各時間點凋亡細胞均明顯增加，差異顯著（P＜0.01）。M1d神經(jīng)細胞凋亡表達至高峰，隨后逐漸下降，MKO組和MWT組有相似的表達規(guī)律。與MWT組比較，MKO組神經(jīng)凋亡細胞表達的較多，各組差異顯著（P＜0.01，圖 3）。

Fig.1 Hematoxylin-Eosin staining in ischemic hippocampus CA1 domain of newbornmice（×400）

Fig.2 Nissl’s staining in ischemic hippocampus CA1 domain of newbornmice（×400）

Fig.3 Expression ofnerve cellapoptosis in ischemic hippocampus CA1 domain of newbornmice.Brown staining represents positive expression in nuclei（TUNELDAB×400）

2.2 新生小鼠HIBD后腦組織P-JNK陽性細胞表達的免疫組化檢測結(jié)果

S組腦組織海馬CA1區(qū)有散在的P-JNK陽性細胞表達，而 SKO組和 SWT組無顯著性差異（P＞0.05）。與S組比較，M組缺血側(cè)海馬 CA1區(qū)各時間點P-JNK陽性細胞表達均明顯增加，差異顯著（P＜0.01）；M1d達高峰，隨后逐漸下降；與 MWT組比較，MKO組有較多的P-JNK陽性細胞表達，以1 d為著（P＜0.01），隨著時間的延長，P-JNK的陽性細胞越來越少，3 d時（P＜0.05），7 d時（P＞0.05，圖 4）。0.01vsWT group

Fig.4 Expression of P-JNK in ischemic hippocampus CA1 domain ofnewbornmice.Brown staining represents positive expression in cytoplasm and nuclei（Immunohistochemistry DAB×400）

2.3 直線相關(guān)性分析

大腦海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細胞凋亡表達與P-JNK的陽性細胞表達呈顯著正相關(guān)（r＝0.837，P＜0.01，圖 5）。

Fig.5 Correlation analysis between expression of P-JNK and expression of nerve cell apoptosis in ischemic hippocampus CA1 of newbornmice（r＝0.837，P＜0.01）

3 討論

圍生期（妊娠28周到生后4周）腦損傷是導(dǎo)致兒童腦性癱瘓，殘疾，精神發(fā)育遲滯、學(xué)習(xí)困難和癲癇等神經(jīng)功能障礙性疾病最主要的原因。例如，缺血、缺氧、黃疸、早產(chǎn)、出血、感染等均是圍生期主要致腦損害的危險因素。生后7日齡的小鼠腦發(fā)育程度類似足月兒，缺氧的時間長短與腦損傷程度有關(guān)，且重度腦損傷不利于腦保護作用的研究，故本實驗采用的是腦缺血后缺氧1 h所導(dǎo)致的輕中度腦損傷，使用7日齡A2ARKO和A2ARWT小鼠制作HIBD模型進行腦損傷發(fā)病機制的研究，初步探討敲除A2AR對新生小鼠HIBD所致神經(jīng)細胞凋亡的影響及可能的作用機制。新生鼠HIBD是整個腦組織經(jīng)歷缺血-缺氧-再灌注的病理生理過程，HIBD模型制作成功的指標(biāo)有：神經(jīng)行為異常、顯微鏡下腦組織病理形態(tài)學(xué)改變、神經(jīng)細胞大量凋亡等，本實驗對這些指標(biāo)進行檢測，結(jié)果表明：M組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為異常；缺血側(cè)腦組織海馬CA1區(qū)在光鏡下顯示M組有明顯的缺血性病理改變，神經(jīng)細胞變性壞死甚至發(fā)生空泡化，尤以1 d組最明顯；同時發(fā)現(xiàn)M組神經(jīng)細胞凋亡較S組顯著增加。這些結(jié)果表明本實驗成功建立新生小鼠HIBD模型。隨著時間的推移，病理變化均逐漸減輕，這一現(xiàn)象表明缺血性腦損傷再灌注期病理變化的減輕可能與神經(jīng)細胞的自身修復(fù)有關(guān)。

腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)普遍存在的一種神經(jīng)遞質(zhì)，各種腦損傷時，由于代謝負(fù)荷加重和組織反應(yīng)能力下降導(dǎo)致胞外腺苷濃度迅速上升，進而產(chǎn)生一系列病理生理效應(yīng)。A2AR在海馬、皮層、紋狀體等處均有表達，但海馬是缺血敏感區(qū)域，且與認(rèn)知密切相關(guān)，故本實驗選取A2AR敲除新生小鼠HIBD后缺血側(cè)海馬進行神經(jīng)細胞凋亡機制的研究。有關(guān)新生大鼠G蛋白偶聯(lián)的A2AR研究發(fā)現(xiàn)出生時CGS 21680的結(jié)合位點是成年鼠的3，5日齡是成年鼠的15.5，15日齡是成年鼠的1／3，25日齡是成年鼠的75，CGS 21680的結(jié)合位點從出生后到成年逐漸增多，所以此結(jié)合位點越少，A2AR的親和力越高，推測早期的A2AR在腦發(fā)育過程中起重要作用［6］。Bona等［7］對7日齡大鼠進行HIBD后給予非選擇性腺苷受體拮抗劑茶堿，A1R拮抗劑（DPCPX），A2AR拮抗劑SCH58261，14 d后發(fā)現(xiàn)茶堿和SCH58261有保護缺氧缺血性腦損傷的作用。腺苷作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護劑，我們的實驗表明，在7日齡新生小鼠 HIBD后，與野生型小鼠相比較，敲除A2AR加重近期行為學(xué)障礙、腦組織病理損傷以及神經(jīng)細胞凋亡，且結(jié)果與 Adén U［8］的研究結(jié)果一致，卻與 Bona等［7］的結(jié)果相矛盾，推測可能與以下因素有關(guān)：（1）受體的數(shù)量：新生鼠A2AR的數(shù)量較成年鼠少；（2）受體的功能：在新生鼠HIBD后使用抑制劑時尚有部分受體存在并且發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)A2AR在成年鼠缺血性腦損傷中與新生鼠HIBD中的作用不同，推測可能是未成熟腦組織缺血性腦損傷的病理生理機制不同所造成。

c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）促進細胞凋亡的機制有二：一是JNK使轉(zhuǎn)錄因子的活性增強，促進 P53、Bax、FasL、TNF等促凋亡蛋白表達；二是作用于線粒體的Bax途徑。JNK通路的激活與細胞凋亡關(guān)系密切，可介導(dǎo)氧化應(yīng)激、細胞因子、紫外線、蛋白質(zhì)合成抑制劑、滲透壓應(yīng)激等。缺血／再灌注模型中發(fā)現(xiàn)特異性腺苷A2AR拮抗劑SCH 58261可通過抑制MAPK通路的表達起到神經(jīng)保護作用［17］，而且該神經(jīng)保護與抑制缺血／再灌注后少突膠質(zhì)細胞JNK／MAPK通路的活化有關(guān)，與小膠質(zhì)細胞 ERK1／2通路活化無關(guān)［2］，A2AR還在控制各種缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡方面起著重要的作用［9、10］。這些結(jié)果表明 A2AR在控制缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡過程中可能與MAPK密切有關(guān)。在實驗過程中，我們觀察到M組海馬CA1區(qū)PJNK陽性細胞的表達較S組明顯增多（P＜0.01）；與MWT組比較，MKO組P-JNK陽性細胞表達明顯增多，以1 d組最明顯，且 P-JNK只在新生小鼠HIBD后的早期高表達；神經(jīng)凋亡細胞與P-JNK陽性細胞的表達呈顯著正相關(guān)，但高表達持續(xù)的時間比PJNK要長。因此敲除A2AR增加新生小鼠HIBD導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡及加重腦損害的過程，可能與早期P-JNK的高表達有關(guān)，提示敲除A2AR可能通過促進早期P-JNK的持續(xù)激活而加重HIBD的神經(jīng)細胞凋亡，推測可能存在其他可能的凋亡機制。

由以上結(jié)果我們可以得出結(jié)論，早期P-JNK的持續(xù)激活可能參與A2AR敲除增加新生小鼠HIBD的神經(jīng)細胞凋亡及加重腦損害的過程。本實驗首次對腺苷敲基因新生小鼠HIBD的凋亡機制進行研究，為腺苷早期用于該類疾病引起的腦功能損害提供實驗依據(jù)。然而要真正闡明A2AR與神經(jīng)凋亡細胞之間的關(guān)系還有待于進一步實驗研究。

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