薛金娟，劉鴻宇

（1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放射科，陜西西安710038；2.中北大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，山西太原030051）

運(yùn)動(dòng)尤其是大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可引起血液、骨骼肌、心肌、主動(dòng)脈和胰腺中一氧化氮（nitric oxide，NO）合成增多。運(yùn)動(dòng)期間NO能夠松馳血管平滑肌，增加血流量、降低運(yùn)動(dòng)期間骨骼肌的氧消耗、促進(jìn)葡萄糖向骨骼肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高肌肉工作效率和機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。Shen等［1］認(rèn)為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能增加NOS的基因表達(dá)，并得出世界級(jí)水平運(yùn)動(dòng)員NO生成較高的判斷。補(bǔ)充NO生成劑是否能夠延緩疲勞成為運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究的熱點(diǎn)。L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）是人體自身可合成的半必需氨基酸，作為NO合成的唯一前體，參與了NO所有生理調(diào)節(jié)過(guò)程。在正常情況下，L-Arg通過(guò)飲食攝入和體內(nèi)鳥(niǎo)氨酸合成即能滿足人體需要，但在大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)情況下L-Arg因過(guò)度消耗而嚴(yán)重缺乏，即體內(nèi)L-Arg合成速度不能滿足運(yùn)動(dòng)中消耗。同時(shí)，Huang等［2］研究發(fā)現(xiàn)口服L-Arg可降低力竭大鼠心肌、肝臟和腎臟中丙二醛的含量，通過(guò)NO的抗氧化性作用延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間，提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力。Mcconell等［3］給運(yùn)動(dòng)員靜脈注射 L-Arg（0.5 g／min，60 min）可增加運(yùn)動(dòng)期間腿部骨骼肌NO含量、四肢血流量和葡萄糖攝取量，從而提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)。上述研究表明口服、灌胃和靜脈注射等方式補(bǔ)充L-Arg均能夠提高運(yùn)動(dòng)能力并延緩疲勞發(fā)生。但目前L-Arg與運(yùn)動(dòng)能力的報(bào)道多側(cè)重于骨骼肌和外周組織，對(duì)于腦組織等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究較少。早期Buchmann等［4］研究表明大鼠腹腔注射0.8 g／kg精氨酸后，腦組織中 L-Arg和瓜氨酸明顯增加，表明外周補(bǔ)充L-Arg可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，從而增加腦內(nèi)含量。提示外周補(bǔ)充L-Arg對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的影響可能與中樞調(diào)節(jié)有關(guān)。腦內(nèi)直接補(bǔ)充L-Arg對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響以及外周補(bǔ)充LArg的中樞機(jī)制，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)側(cè)腦室微注射方法直接改變腦內(nèi)L-Arg含量，觀察大鼠運(yùn)動(dòng)能力和一次性力竭后下丘腦及海馬L-Arg代謝產(chǎn)物——硝酸根 ／亞硝酸根（NO3-／NO2-，NOx-）含量的改變，由此探討L-Arg調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)能力的可能中樞機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠，體重230～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證編號(hào)：SCXK（晉）2009-0001］，自由飲食，室溫（24±2）℃。適應(yīng)環(huán)境 7 d后，以10m／min，10 min／d的運(yùn)動(dòng)量進(jìn)行為期3 d預(yù)運(yùn)動(dòng)，淘汰不擅長(zhǎng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的大鼠。隨機(jī)分為（n＝11）：生理鹽水＋運(yùn)動(dòng)至力竭組（對(duì)照組）；L-Arg＋運(yùn)動(dòng)至力竭組（L-Arg組）。

1.2 主要試劑與儀器

L-Arg（Sigma公司），NO試劑盒（南京建成生物工程研究所），F(xiàn)T-200動(dòng)物跑臺(tái)（成都泰盟科技有限公司），SP-752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 行為學(xué)指標(biāo)

采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)和基本體能，通過(guò)記錄3min內(nèi)大鼠穿格次數(shù)、直立次數(shù)和修飾次數(shù)，間接反映大鼠對(duì)新環(huán)境的探究、興奮性和適應(yīng)能力。分別在手術(shù)前、手術(shù)恢復(fù)后和連續(xù)4 d注藥結(jié)束后三個(gè)時(shí)間段進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

1.4 側(cè)腦室微量注射

大鼠麻醉后，在腦立體定位儀引導(dǎo)下，向一側(cè)側(cè)腦室（坐標(biāo)為：前鹵-1.0mm，中線外側(cè) 1.4 mm，硬腦膜下3.6mm）植入一帶有內(nèi)芯的不銹鋼套管（直徑0.9mm），用牙科水泥將其固定于顱骨。手術(shù)恢復(fù)后，用微量進(jìn)樣器插入套管內(nèi)，于3 min內(nèi)勻速注射完畢，留針2 min。對(duì)照組注射10μl生理鹽水，LArg組注射 10μl L-Arg（500μg）。連續(xù)注藥 4 d。

1.5 一次性跑臺(tái)力竭模型

跑臺(tái)測(cè)試在每天 8∶00～12∶00，室溫（23±2）℃進(jìn)行。第4次注藥結(jié)束后，立刻以速度為18m／min，坡度為5°的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)行一次性力竭測(cè)試，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于最大攝氧量的66%，屬于有氧運(yùn)動(dòng)，記錄運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間（T）并計(jì)算運(yùn)動(dòng)期間所做的總運(yùn)動(dòng)量（W）。大鼠運(yùn)動(dòng)能力由運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間和運(yùn)動(dòng)期間所做總運(yùn)動(dòng)量來(lái)評(píng)定，總運(yùn)動(dòng)量計(jì)算公式如下：其中 W（kgm）為運(yùn)動(dòng)量；m（kg）為大鼠重量；v（m／min）為跑臺(tái)速度 18 m／min；T（min）為運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間；θ為跑臺(tái)坡度。力竭標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠不能堅(jiān)持跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶拖欠達(dá)30 s，連續(xù)給予電或機(jī)械刺激1 min后無(wú)效。腹部與跑道面接觸，呼吸幅度大。下跑臺(tái)后反應(yīng)遲鈍，暫無(wú)逃避反應(yīng)。

1.6 NO檢測(cè)

力竭后從尾靜脈取血0.5 ml，之后立刻斷頭取腦。制成1 mm厚的冰凍腦冠狀切片，根據(jù)大鼠立體定向圖譜，在解剖顯微鏡下用注射針頭分別挖取兩側(cè)下丘腦（視交叉前緣至乳頭體后緣）和海馬，稱重后以冷生理鹽水作勻漿介質(zhì)，研磨制成10%的組織勻漿。離心取上清液，-20℃保存，待測(cè)。亞硝酸根和硝酸根（NO3-／NO2-，NOx-）是 NO在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，NOx-可準(zhǔn)確代表NO水平，具體操作按NO試劑盒說(shuō)明書(shū)（硝酸還原酶法）進(jìn)行。血漿中NOx-含量用μmol／L表示，腦組織中檢測(cè)每克蛋白中NOx-含量（μmol／g pro）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)采用雙因素重復(fù)方差分析，方差齊性時(shí)兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，不齊時(shí)采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)；兩組之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，比較兩組間均值的差異。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)及藥物兩因素對(duì)曠場(chǎng)行為的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示對(duì)照組與L-Arg組在手術(shù)前、手術(shù)恢復(fù)后及注藥結(jié)束后大鼠穿格次數(shù)、直立次數(shù)、修飾時(shí)間均無(wú)明顯變化，即手術(shù)和藥物兩因素對(duì)大鼠探究行為及興奮性等自主行為無(wú)顯著性影響（P＞0.05，表 1）。

Tab.1 Result of open-field test in different stage（±s，n＝11）

Tab.1 Result of open-field test in different stage（±s，n＝11）

Group Pre-operation After recovery After injectio n Wear case number Upright number Modification time（s）Wear case number Upright number Modification time（s）Wear case number Upright number Modification time（s ）Control 103.4±20.1 25.3±5.1 17.0±3.2 101.5±28.6 23.6±5.2 17.5±4.4 107.6±22.9 25.4±3.9 16.4±3.0 L-Arg 100.6±28.7 23.0±4.6 18.0±4.1 102.4±22.3 20.6±5.8 19.6±3.2 102.8±31.4 21.1±3.8 17.7±5.0

2.2 力竭時(shí)間和運(yùn)動(dòng)量

側(cè)腦室注射L-Arg組運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間（150.71±51.77）min與對(duì)照組（99.28±10.90）min相比明顯增加（P＜0.05），升高幅度為 51.8%；L-Arg組運(yùn)動(dòng)量（64.19±23.20）kg m也顯著高于對(duì)照組（42.77±4.80）kgm（P＜0.05），升高 50.08%（圖 1）。

Fig.1 Effect of i.v.c.injection of L-arg on rat’s running in treadmill exercise

2.3 NO濃度變化

運(yùn)動(dòng)力竭后L-Arg組血漿中NOx-濃度為（64.04±13.84）μmol／L，對(duì)照組為（66.06±17.97）μmol／L，兩組相比無(wú)顯著性差別（P＞0.05）。L-Arg組下丘腦 NOx-濃度為（8.93±1.83）μmol／g pro，與對(duì)照組相比顯著增加（P＜0.01）。兩組海馬NOx-濃度也無(wú)顯著差異（P＞0.05，表 2）。

Tab.2 NOx-level of blood，hypothalamus and hippocampus in rats（±s，n＝11）

Tab.2 NOx-level of blood，hypothalamus and hippocampus in rats（±s，n＝11）

**P＜0.01 vs control group

Group Blood（μmol／L）Hypothalamus（μmol／g pro）Hippocampus（μmol／g pro ）Control 66.06±17.97 4.25±0.79 7.52±2.17 L-Arg 64.04±13.84 8.93±1.83**8.58±2.46

2.4 運(yùn)動(dòng)能力與腦內(nèi)NOx-濃度的關(guān)系

大鼠總運(yùn)動(dòng)量與力竭狀態(tài)下下丘腦NOx-濃度呈正相關(guān)性（P＜0.01，圖2A）。大鼠運(yùn)動(dòng)期間總運(yùn)動(dòng)量與力竭狀態(tài)下海馬NOx-濃度無(wú)相關(guān)性（P＜0.01，圖 2B）。

3 討論

Fig.2 Correlation between NOx-concentration in hypothalamus or hippocampus and changes in the total workload till exhaustion（W）

L-Arg不僅能夠產(chǎn)生NO，還能合成蛋白質(zhì)，促進(jìn)血氨進(jìn)入尿素循環(huán)。為了避免L-Arg自身引起的外周效應(yīng)，本文選擇側(cè)腦室直接注射方式。結(jié)果顯示L-Arg組血漿中NO濃度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差別，表明側(cè)腦室注射L-Arg不能引起運(yùn)動(dòng)應(yīng)激狀態(tài)下外周NO變化，排除了運(yùn)動(dòng)過(guò)程中外源性NO通過(guò)舒張血管增加血流量等方式來(lái)影響機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。研究表明側(cè)腦室注射500μg L-Arg可以改變腦內(nèi)NO含量及胃電活動(dòng)，而250μg劑量不能產(chǎn)生相應(yīng)效果［5］；Delwing等［6］可通過(guò)側(cè)腦室注射 5μl，1.5 mmol／L L-Arg（即 1 306μg）建立“高精氨酸血癥”疾病模型，而補(bǔ)充 5μl，0.5mmol／L L-Arg（即 436μg）無(wú)負(fù)面效應(yīng)。所以本文選擇側(cè)腦室注射10μl，500μg L-Arg的適當(dāng)劑量，既能夠改變腦內(nèi)NO含量又不至于引起高精氨酸癥。

本文在手術(shù)前、手術(shù)恢復(fù)后和連續(xù)4 d注藥后分別對(duì)大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，結(jié)果顯示三個(gè)時(shí)間段大鼠穿格次數(shù)和直立次數(shù)均無(wú)顯著變化，表明手術(shù)和藥物因素對(duì)大鼠自主運(yùn)動(dòng)能力及對(duì)興奮性無(wú)明顯影響；同時(shí)大鼠修飾時(shí)間也無(wú)顯著變化，表明手術(shù)和藥物因素對(duì)大鼠在新環(huán)境中的適應(yīng)能力也無(wú)影響。以上表明側(cè)腦室植入套管手術(shù)、連續(xù)4天注射L-Arg對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)行為無(wú)顯著性影響，排除了手術(shù)和藥物對(duì)運(yùn)動(dòng)效果的負(fù)面影響。

大量研究表明口服、灌胃和靜脈注射等外周方式補(bǔ)充L-Arg有利于延緩疲勞的發(fā)生［2，3］。本研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射L-Arg明顯延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間（51.8%），增加總運(yùn)動(dòng)量（50.08%），提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力，說(shuō)明外周和中樞補(bǔ)充L-Arg都能夠改善大鼠運(yùn)動(dòng)能力，延緩疲勞發(fā)生。Lacerda等［7］發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射NOS抑制劑L-NAME引起運(yùn)動(dòng)期間產(chǎn)熱和散熱平衡失調(diào)，導(dǎo)致體溫在運(yùn)動(dòng)11 min后顯著增高，從而誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)疲勞提前發(fā)生。與本文研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了中樞NO參與了運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)，補(bǔ)充L-Arg可能通過(guò)增加中樞NO水平來(lái)發(fā)揮作用。

下丘腦作為神經(jīng)內(nèi)分泌重要核團(tuán)，參與了運(yùn)動(dòng)性疲勞的形成。Kima等［8］發(fā)現(xiàn)禁食應(yīng)激后大鼠室旁核神經(jīng)元型NOS表達(dá)增加，跑臺(tái)訓(xùn)練能減少其含量，王曉東等［9］發(fā)現(xiàn)一次性力竭后大鼠下丘腦NO明顯降低，可能由于運(yùn)動(dòng)期間NOS活性受到抑制或NO前體明顯消耗所致。上述研究說(shuō)明運(yùn)動(dòng)能夠降低下丘腦NO含量。本文經(jīng)側(cè)腦室L-Arg預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)力竭后下丘腦NO含量增加，并且大鼠運(yùn)動(dòng)能力與力竭狀態(tài)下下丘腦NOx-濃度呈正相關(guān)性。表明L-Arg可能通過(guò)下丘腦L-Arg-NO途徑增加腦血流量和保護(hù)神經(jīng)元活性，而延緩疲勞發(fā)生。本文經(jīng)LArg連續(xù)4 d預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)力竭后海馬NOx-含量無(wú)顯著變化，并且大鼠運(yùn)動(dòng)能力與力竭狀態(tài)下海馬NOx-濃度無(wú)相關(guān)性。表明力竭運(yùn)動(dòng)中海馬NO沒(méi)有參與大鼠運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)，可能因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)力竭時(shí)LArg作為NOS底物在海馬腦區(qū)還處于飽和狀態(tài)，根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，底物L(fēng)-Arg飽和時(shí)NOS酶的活性中心就不再改變，暗示在運(yùn)動(dòng)期間海馬L-Arg不缺乏。本文結(jié)果顯示力竭后下丘腦NO含量增加，海馬NO無(wú)顯著變化。表明下丘腦可能是中樞NO參與運(yùn)動(dòng)能力調(diào)節(jié)最主要的腦區(qū)之一。側(cè)腦室注射L-Arg可能只通過(guò)下丘腦L-Arg-NO途徑提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力，延緩疲勞發(fā)生。

中樞NO可影響急性力竭大鼠運(yùn)動(dòng)能力，側(cè)腦室微量注射L-Arg增加大鼠下丘腦NO含量，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間，增加運(yùn)動(dòng)期間總運(yùn)動(dòng)量，從而提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力。L-Arg可能通過(guò)下丘腦L-Arg-NO信號(hào)通路提高運(yùn)動(dòng)能力，延緩運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生，下丘腦可能是中樞NO參與運(yùn)動(dòng)能力調(diào)節(jié)最主要的腦區(qū)之一。

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