任 飛 張曉宇

（1.西南科技大學食品科學與技術研究所，四川 綿陽 621010；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

以瀘州老窖為代表的濃香型大曲酒是以己酸乙酯為主體香味成分，其風格特征：窖香濃郁，綿甜爽凈，回味悠長［1］。幾十年來，濃香型大曲酒深受廣大消費者的喜愛。濃香型大曲含有多種微生物產生的多種酶類，是濃香型大曲酒生產的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，其品質對曲酒的出酒率和酒質都有很大的影響，所以有“曲是酒之骨”的說法［2］。濃香型大曲酒的釀造是在中溫（或中溫偏高溫）大曲的作用下，進行“雙邊”發(fā)酵——邊糖化邊發(fā)酵。在大曲酒的發(fā)酵過程中，濃香型大曲的作用如下：①為大曲酒的入窖糟醅中原料的分解提供酶類：液化酶類、糖化酶類、蛋白酶類、脂肪酶類，等等；②為大曲酒的發(fā)酵提供主要菌種來源，如霉菌、酵母菌、細菌等；③是大曲酒中一些香味物質及香味前體物質的來源；④大曲中淀粉含量高達57%左右，可以為大曲酒的發(fā)酵提供一部分發(fā)酵原料［3］。濃香型大曲中的糖化酶類主要源于微生物在制曲過程中新陳代謝作用，糖化酶類在大曲酒生產的邊糖化邊發(fā)酵過程中起著重要作用。在本試驗中通過測定大曲的糖化酶類的糖化動力學，研究不同反應條件（底物濃度、酶用量、溫度、pH）對大曲糖化反應速率的影響，為濃香型大曲酒的生產工藝控制提供理論的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：來自于四川濃香型大曲酒生產廠家。

乙酸鈉、乙酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、葡萄糖、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸：均為分析純，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

試驗用水：均為純凈水。

1.2 儀器與設備

數(shù)字酸度計：PHS－25，上海雷磁儀器廠；

電子分析天平：BSA124S，德國Sartorius公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DGF3006A，重慶銀河試驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 可溶性淀粉溶液的制備 準確稱取可溶性淀粉，加少量水調勻，加入沸水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后用水定容，制得試驗所需的淀粉溶液。使用時根據(jù)需要稀釋成不同濃度的淀粉溶液。

1.3.2 5%大曲浸出液的制備 5.0g大曲（以絕干曲計），加入90mL水和10mL乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，攪勻，于30 ℃水浴中保溫浸取1h，每隔15min攪拌1次。用脫脂棉過濾，濾液為5%大曲浸出液（酶液），取上清液置于冰水浴中待用。使用前5min將所需量的大曲浸出液取出，裝入干凈的試管中置于糖化反應所需溫度的水浴中，使其達到需要的溫度。

1.3.3 緩沖液的制備 為了測定pH 值對大曲糖化力的影響，需配制pH 值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液［4］。

1.3.4 還原糖含量的測定 斐林試劑法［5］。

1.3.5 糖化反應速率的計算 因為在中溫發(fā)酵時，反應溫度?？刂圃?0 ℃左右。在本試驗中，除研究溫度對酶反應的影響外，反應溫度均控制在30 ℃。根據(jù)要求改變底物（可溶性淀粉）濃度、酶濃度（酶液用量）、糖化反應的pH 值、反應溫度，進行試驗，糖化反應時間均為5 min，糖化反應結束時用0.1mol／L的NaOH（注：測定pH 對糖化反應速率的影響時用0.2mol／L的NaOH）溶液15 mL 終止反應，定容至50mL，取5mL反應液用斐林試劑法測定反應液中還原糖的含量。同時做空白對照，糖化反應速率按式（1）計算：

式中：

V—— 糖化反應速率，mg／（mL·min）；

V1——5mL 糖化液消耗0.1% 葡萄糖標準溶液的體積，mL；

V0—— 空白對照消耗的消耗的0.1% 標準葡萄糖溶液的體積，mL；

C —— 標準葡萄糖溶液的濃度，mg／mL。

2 結果與討論

2.1 底物濃度對大曲糖化速率的影響

以不同濃度的可溶性淀粉作為底物，大曲浸出液用量5mL，反應溫度30 ℃，準確反應5 min后，加入0.1 mol／L的NaOH 溶液15mL，終止反應，定容至50 mL。研究底物濃度變化對大曲糖化反應初速率的影響，試驗結果見圖1。

圖1 底物濃度對糖化反應速率的影響Figure 1 Effect of substrate on initial rate of saccharification

大曲糖化反應是大曲中含有的多種糖化酶共同參與的結果。由圖1可知，反應速率V 對［S］呈典型的雙曲線關系符合經典的表征酶促反應特征的米氏方程的曲線形狀。因此，可將本試驗測得的數(shù)據(jù)與米氏方程進行擬合，用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理，以1／V ～1／［S］作圖，得到如圖2所示的直線。由回歸方程：

可 求 出Vmax＝0.148 0 mg／（mL· min），Km＝25.935 7mg／mL，所以大曲糖化反應的動力學方程為

圖2 Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖法Figure 2 Lineweaver－Burk plot of initial rate of saccharification with substrate concentration

2.2 酶用量對反應速率的影響

底物濃度為15mg／mL，反應溫度為30 ℃，pH 為4.6，糖化酶用量對大曲糖化反應速率的影響見圖3。由圖3 可知，酶用量與糖化反應速率呈線性關系。當?shù)孜餄舛缺让笣舛却蠛芏?，即［S］＞＞［E］，因此被酶結合的S 量，亦即［ES］，它與總的底物濃度相比，可以忽略不計。根據(jù)酶反應的中間復合物學說［6］得出式（4）：

上述兩步反應都是可逆的，它們的正反應與逆反應的速率常數(shù)分別為k1、k2、k3、k4，可以推導得出：

圖3 酶用量對糖化速率的影響Figure 3 Effect of enzyme concentration on initial rate of saccharification

式（5）表明酶反應體系中反應速率V 與酶濃度［E］呈正比，與試驗結果相符。

在濃香型大曲酒的生產中，可以通過大曲的用量來控制糖化反應速率，夏季氣溫較高，要使大曲酒的發(fā)酵過程符合“前緩、中挺、后緩落”，必須減少用曲量，一般情況下，夏季的用曲量為投糧量的18%，冬季用曲量為投糧量的21%［6，7］。

2.3 pH 對糖化速率的影響

底物濃度為15mg／mL，糖化反應的溫度為30 ℃，酶用量為5mL，利用5mL磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液調劑反應體系的pH 值，研究在不同的pH 條件下大曲糖化反應速率，反應結束時，用0.2mol／L 的NaOH 溶液終止反應，試驗結果見圖4。由圖4可知，當pH 值在3.0～6.0時，糖化反應速率隨pH 值的升高而逐漸增加；當pH 值在6.0～8.0時，糖化反應速率隨pH 的升高而逐漸降低；因此，濃香型大曲糖化酶的最適pH 為6.0。

圖4 pH 對大曲糖化反應速率的影響Figure 4 Effect of pH on the initial rate of saccharification

在釀造濃香型大曲酒的過程中，控制入窖糟醅的pH 可以控制糖化反應的速率，有利影響有3個方面：①過酸或過堿可導致酶活性的喪失，空間結構被破壞；②當pH 值的改變不太劇烈時，酶雖未變性，活力可能受到影響；③pH 可影響維持酶分子的空間結構有關基團的解離，進而影響酶活性部位的構象，酶的活性可能受到影響［8］。

由圖4可知，大曲糖化反應速率與pH 呈鐘罩形曲線，表明pH 對大曲中糖化酶類的糖化反應的影響與對單一糖化酶的影響類似。“雙邊發(fā)酵”順利地進行，可以提高大曲酒的質量和產量。

2.4 溫度對大曲糖化速率的影響

溫度是影響酶活性的重要因素，研究酶的最適溫度，在工業(yè)生產中有重要的意義［9］。底物濃度為15 mg／mL，pH為4.6，酶液用量為5mL，在不同的溫度條件下測定大曲的糖化反應速率，溫度對大曲糖化反應速率的影響見圖5。

由圖5可知，在10～50 ℃時，大曲的糖化反應速率隨著溫度的升高而增加。這是因為當溫度升高時，酶催化反應與一般化學反應一樣，反應速率加快［8］。在通常情況下，窖池內糟醅的發(fā)酵溫度最高不會超過40 ℃。在這一溫度范圍之內，大曲的糖化反應速率隨著溫度的升高而增加。酵母菌在高溫下過早衰亡，使得發(fā)酵無法徹底地進行下去，到發(fā)酵中期，發(fā)酵相當微弱，所以導致了出酒率的下降［6］。濃香型大曲酒傳統(tǒng)的入窖溫度是“熱平地溫冷13 ℃”，也就是控制較低的溫度入窖發(fā)酵，控制“低溫緩慢發(fā)酵”，做到“前緩、中挺、后緩落”。夏季氣溫較高應調整作息時間，利用氣溫較低的夜間和早晨進行生產，盡量避免在氣溫較高的中午進行生產，來減慢糖化反應的速率［10，11］。由表1可知，溫度對大曲糖化反應速率有較大的影響，濃香型大曲糖化反應速率是溫度的函數(shù)。

圖5 溫度對大曲糖化反應初速率的影響Figure 5 Effect of temperature on the initial rate of saccharification

表1 不同溫度下的糖化反應速度Table 1 Initial rate of saccharification in different temperature

將表1中的試驗數(shù)據(jù)，以lnV－1／T 作圖，可得如圖6所示的直線，R2＝0.988 1，說明用阿侖尼烏斯方程擬合本試驗數(shù)據(jù)是高度顯著的，表明糖化反應速度隨溫度的變化服從阿累尼烏斯（Arrhenius）方程：

式中：

A—— 指前因子；

E—— 活化能，J／mol；

R—— 通用氣體常數(shù)，8.314J／（mol·K）；

T—— 開氏溫度，K。

可求出：指前因子A ＝6.21×105mg／（mL·min），活化能E ＝40.966kJ／mol；與鐘穗生等［12］報道的馬鈴薯淀粉糖化反應的活化能E ＝41.165kJ／mol比較接近。

圖6 lnv 與1 000／T 的關系圖Figure 6 Relationship of lnv with 1 000／T

3 結論

濃香型大曲作為濃香型大曲酒生產的糖化發(fā)酵劑，含有由多種微生物產生的多種糖化酶。用5%濃香型大曲浸出液水解可溶性淀粉，在pH 4.6、30 ℃的條件下，濃香型大曲糖化酶的米氏方程為V ＝0.148 0［S］／（25.935 75＋［S］）；糖化反應的最適pH 值為6.0；在不同溫度下測定糖化反應速率，計算得到活化能E 為40.966kJ／mol。濃香型大曲糖化酶類的糖化反應動力學與單一酶相似，這可能是因為酶具有專一性，以淀粉為底物時，只有糖化酶類起作用。通過控制淀粉濃度（投糧量）、用曲量、入窖酸度和溫度可以使?jié)庀阈痛笄频奶腔l(fā)酵過程協(xié)調進行，以提高濃香型大曲酒的產量和質量。

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10 劉洪振，王中林，劉社鋒，等.夏末秋初濃香型大曲酒生產轉排的經驗總結［J］.釀酒科技，1995（3）：21～22.

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