陳麗華 潘自紅 曹云麗 馬慶一

（平頂山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 平頂山 467000）

餐后高血糖是糖尿病病情加重并導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的主要因素［1，2］，因此，合理控制餐后血糖異常升高，在防治糖尿病尤其是Ⅱ型糖尿病的防治上起到至關(guān)重要的作用。食物中碳水化合物等在唾液和胰α－淀粉酶作用下先水解為寡糖，后經(jīng)小腸上皮絨毛膜刷狀緣上α－葡萄糖苷酶的作用生成單糖再進(jìn)入血液是餐后血糖升高的主要原因，若能控制血糖生成的關(guān)鍵酶α－葡萄糖苷酶的活性就可以減緩寡糖水解，阻礙糖的吸收，降低餐后血糖的峰值，使其平穩(wěn)于一定水平上［3］。

知母為百合科植物知母的干燥根莖，是中國傳統(tǒng)常用中藥材。知母的根莖中除了含有芒果苷、膽堿、尼克酰胺、鞣酸、煙酸以及4種知母多糖外，還含鐵、鋅、錳、銅、鉻、鎳等多種金屬元素以及黏液質(zhì)、還原糖等［4］，具有清熱瀉火、生津潤燥之功效［5］，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有知母可用于消渴癥治療的記載，且為“玉液湯”主藥。盧盛華［6］發(fā)現(xiàn)知母聚糖能降低正常小鼠和由四氧嘧啶誘發(fā)的高血糖大鼠的血糖；研究人員［7］還發(fā)現(xiàn)用知母水性提取物0．15g／kg注射糖尿病小鼠，5h后血糖下降80%且尿中酮體減少。但從目前所報道的知母降血糖的研究情況來看大多都還十分粗淺［8］，僅僅停留在初級水平上，本課題旨在系統(tǒng)研究知母中潛在的活性物質(zhì)對α－葡萄糖苷酶抑制活性的貢獻(xiàn)，從而為進(jìn)一步研究構(gòu)效關(guān)系和研發(fā)降糖新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

知母：鄭州藥材批發(fā)市場；

4－硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷（PNPG）：德國E．Merck公司；

α－葡萄糖苷酶：美國Sigma公司；

對硝基苯酚（PNP）：儀征市鼎信化工有限公司；

大孔樹脂：APD－600型，西安樹脂廠；

其它所用試劑：均為國產(chǎn)分析純；

微量移液器：QYQ 型，北京表云航空儀表有限公司；

三用紫外燈：ZF－C型，上?？岛坦怆娖饔邢薰?；

紫外可見分光光度計：756型，上海分析儀器廠；

轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：ZFQ85A 型，上海醫(yī)專械機(jī)廠；

磁力攪拌器：85－2型，江蘇中大儀器廠；

高速臺式離心機(jī)：TGL－18C型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

離心沉淀器：80－1型，上海手術(shù)器械廠。

1．2 試驗方法

1．2．1 知母各成分的提取

（1）原料的處理：知母，37 ℃烘干，粉碎，取過40目篩的知母粉于冰箱4 ℃冷藏，備用。

（2）知母水溶性總物質(zhì)的提?。悍Q取上述冷藏備用的知母粉20g置于磨口圓底燒瓶中（500mL），加蒸餾水（初次提取固液比設(shè)為1∶8（m∶V）），燒瓶置于恒溫水浴中60 ℃攪拌2h后，立即抽濾，濾渣再用蒸餾水重提2h（再次提取固液比設(shè)為1∶5（m∶V）），抽濾，合并兩次濾液，真空濃縮至40mL。加聚酰胺15% （m／V）靜置過夜，抽濾去掉聚酰胺；濾液再加少量大孔樹脂（APD－600）放置24h，抽濾；加硅藻土和活性炭各5% （m／V）于55 ℃脫色0．5h，抽濾，濾液定容到50mL，即為知母水粗提液［9］。

（3）知母中皂苷與知母黃酮的提取與純化：取知母粉20g，置于500 mL 圓 底 燒 瓶 中，加 入95%乙 醇［10，11］提 取 兩次，提取方法同1．2．1（2）中，兩次抽濾后濾液合并，并于低溫（35 ℃）真空濃縮至膏狀，溶于20mL 蒸餾水，石油醚萃取3次（15mL×3）；下層水相再用正丁醇萃取4次（10mL×4）；隨后合并丁醇相并減壓蒸干，移樣槍轉(zhuǎn)移溶于16 mL 甲醇中，加5倍體積的乙醚于冰箱中靜置，24h后，過濾，留沉淀，上清液再加乙醚約50mL 同樣操作至不再產(chǎn)生沉淀。最后收集合并所得沉淀物溶于10mL 蒸餾水，溶液為粗皂苷液，取少量備用，其余樣液過大孔樹脂柱，依次用蒸餾水和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫［12］，跟蹤檢測洗脫液，直至將粗皂苷中的皂苷和黃酮分離，合并相同組分并減壓濃縮至浸膏狀，各用40mL和15mL水溶解，即得知母皂苷和黃酮樣液［9］。

（4）知母中多糖的提?。簩⒋继嶂冈碥蘸忘S酮過程中所剩的濾渣置于500mL圓底燒瓶中，按1．2．1（2）提取。合并兩次濾液，真空濃縮至少量時加入95%乙醇沉淀，收集沉淀，再用蒸餾水定容至50mL，即為多糖樣液［9，13］。

（5）各提取物得率的測定：取干燥潔凈稱量瓶，用分析天平準(zhǔn)確稱量，記錄其重量，編號備用，移入所得不同的提取物的樣液各0．5mL后，自然干燥至恒重，再稱量，記錄數(shù)據(jù)，此試驗各成分各作2組平行試驗取其平均值，由該數(shù)據(jù)、所得樣液體積和提取時所取原料的重量來計算提取率。

1．2．2 知母中活性成分的定性檢測 知母中各活性成分的定性檢測方法見參考文獻(xiàn)［14］和［15］。

1．2．3 知母中各抑制劑活性測定方法

（1）知母中各抑制劑的活性測定：反應(yīng)體系如表1所示，底物、緩沖液和知母提取得到的各抑制劑都按下表比例先于室溫下加入比色皿中穩(wěn)定5min后，再加入酶液，在400nm下測定吸光度，酶液加入后，瞬間開始計時，每1min讀取1次吸光值。為扣除抑制劑本身的影響，每種抑制劑測定時都作相應(yīng)不加抑制劑的空白對照試驗，另為扣除底物PNPG 的影響，再做一組不加酶的空白對照試驗。定義抑制劑一個活力單位為吸光度每分鐘減少0．001［16］。抑制率按式（1）計算。

式中：

C—— 抑制率，%；

AX1—— 加抑制劑但不加酶的吸光值；

AX0—— 加入抑制劑也加入酶后的吸光值；

AY1—— 不加抑制劑也不加酶的吸光值；

AY0—— 不加抑制劑但加入酶的吸光值。

表1 各提取液抑制活性的反應(yīng)體系Table1 Reactant system for evaluate the effects of extracts on the activity ofα－glucosidase

知母水提液、多糖、皂苷和拜堂平濃度均為5．60mg／mL。黃酮濃度為5．60mg／mL 時顏色深，超出測定范圍，選濃度為0．88mg／mL。

（2）不同濃度皂苷和黃酮抑制活性的測定：試驗設(shè)計見表2和表3，每個濃度下都以不加酶的相同混合液作為對照，然后作抑制率－ 抑制劑濃度圖確定最大半抑制濃度IC50［17］。

表2 不同濃度皂苷的抑制活性測定反應(yīng)體系Table2 Reactant system for evaluate the effects of Saponins on the activity ofα－glucosidase

表3 不同濃度黃酮的抑制活性測定反應(yīng)體系Table3 Reactant system for evaluate the effects of flavone on the activity ofα－glucosidase

2 結(jié)果與討論

2．1 知母中活性成分的分離與定性檢測

將知母水提液、粗皂苷、多糖提取液經(jīng)三氯化鐵試驗、鹽酸－鎂粉試驗、α－萘酚試驗、明膠試驗、氯仿－濃硫酸試驗、醋酐濃硫酸試驗等的定性測定，結(jié)果見表4。

由表4可知，知母粗皂苷中含有黃酮組分。上大孔樹脂柱分離純化黃酮和皂苷，跟蹤檢測洗脫液，結(jié)果見表5。

試驗結(jié)果顯示20%～40%乙醇洗脫液主要含知母黃酮，而80%和95%乙醇洗脫液只含知母皂苷，說明知母皂苷和黃酮已得到分離。綜合表4、5得知，知母中所得的各抑制劑成分已基本得到分離。

2．2 知母中活性成分得率的測定

從知母中提取、分離并部分純化得到水粗提物、皂苷、黃酮以及多糖等組分。它們的得率分別為19．75%，5．00%，1．05%，13．20%。

表4 各提取液的定性檢驗結(jié)果總表Table4 The results of qualitative test for inhibitors extracted fromRhizoma Anemarrhenaes

2．3 知母中活性成分的酶抑制活性測定

底物濃度為2mmol／L，抑制劑濃度5．6mg／mL 時測得各組分對酶的抑制效果，與拜堂平的比較見圖1。

由圖1可知，知母皂苷、黃酮、水提液、多糖均有不同程度的抑制作用，其中知母皂苷和黃酮明顯優(yōu)于拜堂平。取第15分鐘的值計算抑制率，作抑制率圖見圖2，皂苷和黃酮濃度分別為5．60，0．88mg／mL 時其抑制率分別為72．94%和37．91%，均高于拜堂平（5．6mg／mL）的抑制率33．52%，而水提液、多糖的濃度為5．6 mg／mL 時的抑制率分別是6．04%和11．8%，低于拜堂平。因為皂苷和黃酮的抑制效果好，故對它們作進(jìn)一步研究。

圖1 各提取組分對酶作用的時間與吸光度曲線圖Figure1 The absorb value curves depending on time of all inhibitors extracted fromRhizoma Anemarrhenaes

圖2 不同抑制劑的抑制率Figure2 The inhibit ratio of all inhibitors extracted from Rhizoma Anemarrhenaes and Acarbose

2．4 皂苷濃度對酶反應(yīng)速度的影響

不同濃度的皂苷反應(yīng)體系所測得的吸光度值對時間做圖見圖3。根據(jù)圖3中直線部分（0～1min）求斜率，即1min內(nèi)的平均反應(yīng)速度，求得相對反應(yīng)速度，作相對反應(yīng)速度－皂苷濃度圖見圖4。

由圖4可知，隨著皂苷濃度的增大，酶活性不斷降低，而抑制活性逐步增加，當(dāng)達(dá)4．2mg／mL 時其抑制活性基本保持不變。說明皂苷的濃度與抑制活性有明顯的量效關(guān)系。并從圖4中求出半抑制濃度［17，18］IC50為1．0mg／mL。

2．5 黃酮濃度對酶反應(yīng)速度的影響

不同濃度的黃酮反應(yīng)體系所測得的吸光度值對時間做圖見圖5。

圖3 不同濃度皂苷對酶反應(yīng)速度的影響Figure3 Enzyme reaction speed depending on the concentration of saponins

圖4 相對反應(yīng)速度－皂苷濃度曲線Figure4 Saponins concentration－relative reaction rate curve

圖5 不同濃度黃酮對酶反應(yīng)速度的影響Figure5 Enzyme reaction speed depending on the concentration of flavone

根據(jù)圖5中直線部分求斜率（0～1min），即1min內(nèi)的反應(yīng)平均速度，求得相對反應(yīng)速度，并作相對反應(yīng)速度－抑制劑濃度圖見圖6。

由圖6可知，隨著黃酮濃度的增大，酶反應(yīng)速度不斷降低，而抑制活性逐步增加，當(dāng)黃酮濃度達(dá)到0．65 mg／mL 時其抑制活性基本保持不變。并由圖6可推測出半抑制濃度IC50＞0．75mg／mL。

3 結(jié)論

圖6 相對反應(yīng)速度－黃酮濃度曲線Figure6 Flavone concentration－relative reaction rate curve

試驗結(jié)果表明知母中各抑制劑成分均可不同程度地抑制α－葡萄糖苷酶的活性，其中知母皂苷和黃酮的抑制率分別為72．94%和37．91%，均高于拜堂平，這說明知母各提取物均是α－糖苷酶抑制劑類降糖新藥的良好候選物，試驗得知母皂苷的半抑制濃度IC50＝1．0mg／mL，知母黃酮的半抑制濃度IC50＞0．75mg／mL，這些數(shù)據(jù)為深入研究α－葡萄糖苷酶抑制劑的活性機(jī)理及其藥理和降糖新藥的開發(fā)提供了新的理論參考，但這兩種抑制劑的抑制類型，最適抑制濃度等都還有待進(jìn)步深入研究。該研究說明從中藥知母中篩選天然α－葡萄糖苷酶抑制劑切實可行，使用安全、來源廣泛且相對成本低廉，這對充分開發(fā)、利用中國豐富的藥用自然資源有深遠(yuǎn)的意義。

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