陳澤斌，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，陳海如

1云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，玉溪，653100；2昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南，昆明，650214；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明，650201

煙草黑脛病(P. parasiticavar.nicotianae)是1896年Breda de Haan在印尼爪哇煙草上發(fā)現(xiàn)的一類土傳真菌病害，煙農(nóng)俗稱“黑根”、“黑稈瘋”。多發(fā)生于成株期，也有少數(shù)苗床期發(fā)生[1]。該病是煙草的毀滅性病害，現(xiàn)已遍布世界各產(chǎn)煙國。在我國，除較冷的黑龍江省外，其他各產(chǎn)煙省均有不同程度的發(fā)生，且危害較為普遍和嚴(yán)重，發(fā)病率一般在10%-15%，年均經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1億元人民幣以上[2]。近年來，研發(fā)安全、有效的拮抗微生物制劑已備受關(guān)注。以往報(bào)道的防治煙草黑脛病菌的拮抗微生物主要是從根圍分離的真菌、細(xì)菌，但定殖差，防效不穩(wěn)定[3]。植物內(nèi)生細(xì)菌大量存在于健康和患病的植物組織中[4,5]。其作為新的生防因子防治植物病害已成為近10年微生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，內(nèi)生細(xì)菌能很好地分布于植株體內(nèi)，防效比附生菌更穩(wěn)定持久[6-7]。國內(nèi)外有關(guān)研究報(bào)道不斷增加，其中關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主植物的抗病促生作用更是人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。王萬能等[8]研究表明，內(nèi)生細(xì)菌不僅對(duì)煙草黑脛病菌有直接拮抗作用，而且具有誘導(dǎo)抗病作用，用菌液處理植株后，POD，PPO和PAL酶活性上升變化明顯。陳博[9]從巴西香蕉中分離到一株能夠明顯抑制尖孢鐮刀菌的內(nèi)生類芽孢桿菌，該菌株不僅能夠抑制香蕉枯萎病的發(fā)生，同時(shí)能顯著促進(jìn)香蕉苗生根，促生效果與植物生長素IAA相似。楊友才等[10]研究表明，內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液能有效殺死根結(jié)線蟲二齡幼蟲，抑制并減少根結(jié)線蟲的侵入，使移栽的煙苗能迅速返苗，增強(qiáng)煙株的抗性，并防治根結(jié)線蟲的侵染。祈之秋等[11]研究表明，內(nèi)生細(xì)菌可通過分泌抗菌物質(zhì)，來抑制病菌菌絲的生長和分生孢子萌發(fā)，防治或減輕病害發(fā)生。因而植物內(nèi)生細(xì)菌是具有病菌拮抗作用和病害生物控制潛力的重要微生物資源。顯示出了內(nèi)生細(xì)菌作為對(duì)環(huán)境無公害的生物農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用的良好前景。

鑒于云南生態(tài)多樣性，生物多樣性，微生物種類較多，煙草種植面積較大。為此，筆者對(duì)云南省各煙區(qū)大量采樣，從煙草的不同組織中分離出多種內(nèi)生細(xì)菌，篩選出有效的黑脛病拮抗菌株并對(duì)其促生作用進(jìn)行研究，對(duì)于挖掘和利用有益的防病促生細(xì)菌具有一定的理論和實(shí)踐意義。

1 材料和方法

1.1 供試煙草樣品和病原物

針對(duì)云南不同煙區(qū)、不同生長期的葉及成熟期的根、莖進(jìn)行采樣。采樣時(shí)選擇生長性狀良好、無病蟲害癥狀的健康植株。樣品從植株分離后裝于密封的塑料袋中，冷藏箱中低溫保鮮，在24h之內(nèi)進(jìn)行處理。煙草黑脛病菌162及烤煙紅花大金元種子由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

內(nèi)生細(xì)菌分離和培養(yǎng)用改良的NA[12]、液體培養(yǎng)用LB[12]，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)用CA[12]。內(nèi)生細(xì)菌DNA提取、16SrDNA片段擴(kuò)增、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程(大連)產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離和拮抗菌的篩選

[13]的方法進(jìn)行煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化。煙草黑脛病菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選和發(fā)酵濾液拮抗作用測定按照參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

1.4 拮抗菌株對(duì)盆栽煙草黑脛病的防治效果測定

1.4.1 接種體的制備及接種方法

按參考文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行。

1.4.2 發(fā)病調(diào)查與病情數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)培養(yǎng)液濾液抑菌活性測定結(jié)果，選擇抑菌活性均達(dá)顯著水平的8個(gè)菌株進(jìn)行了溫室盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)共9個(gè)處理，每處理10株。接種14d后調(diào)查發(fā)病情況。煙草黑脛病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23222-2008)規(guī)定執(zhí)行。

1.4.3 拮抗細(xì)菌培養(yǎng)液灌根對(duì)煙草苗期生長的影響

以盆栽試驗(yàn)中灌根后且在接種黑脛病菌之前的煙株為觀測樣本，每處理隨機(jī)選擇4株，分別測量其株高、最大葉長、最大葉寬、莖圍。對(duì)各處理的促生效果采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)7.05版進(jìn)行Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

1.5 菌株wy11的16S rDNA鑒定

細(xì)菌基因組DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit，方法參見試劑盒說明書。PCR擴(kuò)增選用引物F27/R1492[15]，常規(guī)條件擴(kuò)增[16]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa Agarose Gel DNA Puri fication Kit回收后，連接于載體pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，挑取白色菌落以M13F/M13R為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性克隆委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，將測得的16S rDNA 全序列用EzTaxon server (http://www.eztaxon.org/)進(jìn)行同源性搜索[17]，并用DNAstar軟件，將該序列與已報(bào)道的芽孢桿菌菌株的16S rDNA全序列進(jìn)行同源性比較，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草內(nèi)生細(xì)菌的平板抑制作用測定

從不同地區(qū)、不同生長期和不同器官的煙樣中一共分離純化出127株內(nèi)生細(xì)菌。從中篩選出對(duì)煙草黑脛病菌有較強(qiáng)拮抗作用的菌株12個(gè)（表1），它們的抑菌帶清晰透明，寬度均達(dá)到5mm以上（圖1）。對(duì)病原菌的擴(kuò)展具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)在菌落邊緣和抑菌帶接觸部位的菌絲溶解，整個(gè)菌落的生長明顯受到抑制。培養(yǎng)液濾液抑菌活性測定結(jié)果表明（表1），除了cg16、cj22、wy3、wy5對(duì)煙草黑脛病菌抑菌活性與對(duì)照無顯著差異外，其余8個(gè)菌株的抑菌活性均達(dá)顯著水平，其中wy2、wy11、wy4培養(yǎng)濾液的抗菌活性最強(qiáng)（＞30%），菌絲在其無菌濾液培養(yǎng)基上生長緩慢，挑取菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，黑脛病菌菌絲形態(tài)與對(duì)照有明顯差異，處理后的菌絲形態(tài)開始變化，一些菌絲顏色加深，扭曲變形，不規(guī)則分支（圖2A）；部分菌絲變得透明干癟，中空干枯，且出現(xiàn)部分消融，失去生活能力（圖2B）；許多菌絲細(xì)胞出現(xiàn)膨大空泡呈結(jié)節(jié)狀，凸起變形，細(xì)胞膨大部分胞壁破損，原生質(zhì)外滲（圖2C）。對(duì)照菌絲則生長旺盛,菌絲密集飽滿。將異常菌絲轉(zhuǎn)接到CA培養(yǎng)基培養(yǎng)，以正常黑脛病菌菌絲為對(duì)照，異常菌絲幾乎不能生長。說明這3株菌在生長代謝過程中產(chǎn)生了具有抑菌活性的次生代謝物質(zhì)，抗生是其抗菌的重要機(jī)制，這尚有待于進(jìn)一步研究。cg16、cj22、wy3、wy5的培養(yǎng)濾液抑菌活性最小，說明這4株細(xì)菌的抗菌機(jī)制不是拮抗物質(zhì)的抑菌作用。

表1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌及其發(fā)酵濾液對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制效果

圖2 培養(yǎng)液濾液對(duì)煙草黑脛病菌菌絲形態(tài)的影響(10×40)

2.2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病的盆栽防治效果測定

選 擇 cg24、cj27、cj17、cj20、wy2、wy11、wy4、wy16共8個(gè)煙草內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行溫室盆栽防效驗(yàn)，病情調(diào)查結(jié)果表明（表2），在接種煙草黑脛病菌后第14天，各處理均不同程度地發(fā)病，對(duì)照大部分萎蔫，表現(xiàn)出煙草黑脛病的典型癥狀。除菌株cj27外，其它7株內(nèi)生細(xì)菌菌液澆灌處理均顯示出一定的防病效果，防治效果為6.5%-51.7%。其中以wy11表現(xiàn)突出，防效為51.7%，明顯高于其他菌株。經(jīng)拮抗細(xì)菌wy11處理的煙株，葉色正常，煙株生長發(fā)育正常，而對(duì)照煙株葉片枯黃，煙株的生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響。

表2 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病溫室防治效果

2.3 拮抗細(xì)菌培養(yǎng)液灌根對(duì)煙株生長的影響

盆栽試驗(yàn)中觀察各菌株對(duì)煙草植株的生長情況表明（表3），與LB對(duì)照相比，8株拮抗內(nèi)生菌發(fā)酵液對(duì)煙草植株的生長均有不同程度的影響，其中cj17和wy11對(duì)煙株有較好的促生效果。主要表現(xiàn)在對(duì)莖圍、葉長、葉寬等地上部分生物量的增加。從內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙株株高的影響來看，菌株cj17處理與對(duì)照達(dá)到顯著性差異，有明顯的促生作用；cj17、wy11、wy4處理的煙株莖圍與對(duì)照達(dá)到顯著性差異，能增加煙株的莖圍；cj17和wy11處理的煙株葉長和葉寬與對(duì)照達(dá)到顯著性差異，使葉長、葉寬增加；菌株cj17和wy11處理的煙株單葉面積與對(duì)照達(dá)到顯著性差異，增加幅度分別為30.5%和34.6%?？梢姡琧j17和wy11菌株的代謝產(chǎn)物中存在某些能夠促進(jìn)寄主植物生長的物質(zhì)。證明菌株wy11除了具有一定的防病作用以外，還具有一定的促生作用。

表3 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液灌根對(duì)煙株生長的影響

2.4 菌株wy11的16S rDNA鑒定

測序結(jié)果表明菌株wy11的16S rDNA全序列長度為1514bp，將測得的16S rDNA全序列用EzTaxon server (http://www.eztaxon.org/)進(jìn)行同源性搜索[17]，與其同源性最高的菌為解淀粉芽孢桿菌相似性為99%。在Ribosomal Database數(shù)據(jù)庫中選取9株屬于Bacillus屬的不同種的芽孢桿菌模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹查看屬種間的遺傳進(jìn)化關(guān)系(圖3)，從系統(tǒng)發(fā)育樹看，wy11與B.amyloliquefaciens(AB255669)處于同一分支，說明兩者的遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，因此將菌株wy11鑒定為B. amyloliquefaciens。

圖3 菌株wy11的16S rDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

目前的植物病害生防菌絕大多數(shù)是從土壤或植物根際土壤中分離篩選得到，但由于這些土壤微生物易受外界條件的影響，在與土壤習(xí)居微生物的競爭中不易長期定殖生存并占優(yōu)勢，因而極大的影響了它們的實(shí)際防病效果。近年來的研究表明，植物內(nèi)生菌是很好的生防資源，因?yàn)閮?nèi)生菌能夠系統(tǒng)的分布于植物組織內(nèi)部，環(huán)境變化對(duì)其影響較小，相對(duì)于其它生防因子而言更具優(yōu)勢。因此，內(nèi)生生防菌的篩選與應(yīng)用成為了近年來植物病害生物防治研究的熱點(diǎn)，并取得了很大進(jìn)展。

針對(duì)煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一煙草黑脛病開展防病內(nèi)生細(xì)菌的篩選，獲得了一株有一定防病效果的內(nèi)生細(xì)菌wy11。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一些菌株在平板對(duì)峙試驗(yàn)中有較好的抑菌活性，但其代謝產(chǎn)物卻沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的活性，說明其抗菌的機(jī)制可能是占據(jù)生態(tài)位或營養(yǎng)競爭，而不是分泌抗菌活性物質(zhì)。在研究拮抗內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液灌根對(duì)煙株生長的影響試驗(yàn)時(shí)，考慮到LB培養(yǎng)基中可能含有一些生長促進(jìn)因子，進(jìn)行了LB培養(yǎng)基對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)wy11和cj17對(duì)煙株的莖圍、最大葉長、葉寬具有一定的促生作用。這與文獻(xiàn)報(bào)道的植物內(nèi)生細(xì)菌可以產(chǎn)生某些促生物質(zhì)，并直接促進(jìn)植物生長的結(jié)論一致[18]。

篩選到的拮抗內(nèi)生細(xì)菌雖然在平板對(duì)峙培養(yǎng)中表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，但在對(duì)煙草黑脛病的盆栽防治試驗(yàn)中效果卻不盡人意，防效最高為51.7%，可能是由于不同菌株在自然土壤環(huán)境中對(duì)煙株的侵入定殖能力、自身的增殖能力和存活能力不同所致。David[19]認(rèn)為離體條件下內(nèi)生菌抑制病原菌的能力與其在活體上抑制病原菌所致病害的能力不存在正相關(guān)關(guān)系，篩選到的菌株可能無用，而一些有用的菌株也可能因此被丟棄。因此抑菌帶的寬度并不代表盆栽防效的大小，室內(nèi)篩選必須與盆栽防治效果測定相結(jié)合。

通過16S rDNA序列比對(duì)將防病促生內(nèi)生細(xì)菌wy11鑒定為解淀粉芽孢桿菌。B. amyloliquefaciens是一類重要的生防細(xì)菌，是芽孢桿菌屬(Bacillus)中研究程度僅次于枯草芽孢桿菌的革蘭氏陽性生防菌?？梢源碳ぶ参锷L和產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物抑制多種植物病原物。而且芽孢桿菌對(duì)外界環(huán)境的耐受力強(qiáng)，能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，這有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖[20]。菌株wy11在煙草防病促生方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，本試驗(yàn)只完成了前期的研究工作，其防病促生機(jī)理，實(shí)用發(fā)酵條件和大田應(yīng)用效果等還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Van Breda De Haan. De Bibiziekte in de Delitabak veroorzaakt doorPhytophthora nicotianae.Mded[J]. Slands Plentuim, 1896,15:1-107.

[2]孔凡玉, 朱賢朝, 石金開, 等. 我國煙草侵染性病害發(fā)生趨勢及防治對(duì)策[J]. 中國煙草科學(xué), 1995(1):31-34.

[3]方敦煌, 顧金剛, 李江濤, 等. 煙草黑脛病菌的拮抗根際細(xì)菌的篩選[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 16 : 93-95.

[4]Misaghi I J, Donndelinger C R. Endophytic bacteria in symptom free cotton plants [J]. Phytopathology, 1990,80(9):808-811.

[5]Andrews J H. Biological control in the phyllosphere [J].Annual Review of Phytopathology, 1992, 30:603-635.

[6]楊梅蓮, 孫皖朗, 宋未. 植物內(nèi)生細(xì)菌的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1998, 25 (4) : 224-227.

[7]劉云霞. 植物內(nèi)生細(xì)菌的研究與應(yīng)用[J]. 植物保護(hù),1994, 20 (5) : 30-32.

[8]王萬能, 肖崇剛, 楊水英, 等. 煙草內(nèi)生細(xì)菌118菌株對(duì)煙草抗性相關(guān)酶的誘導(dǎo)作用研究[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2004, 35(3):216-217.

[9]陳博, 朱軍, 孫前光, 等. 一株抗香蕉枯萎病內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及其抗病促生作用[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2011,38(2):199-205.

[10]楊友才, 黃曉輝, 龔理, 等. 煙草內(nèi)生菌對(duì)煙草根結(jié)線蟲病的防治效果[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 28(11):2269-2272.

[11]祈之秋, 李興海, 王英姿, 等. 辣椒根腐病內(nèi)生拮抗細(xì)菌篩選及菌株HJ33-7的鑒定和抗菌活性[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2011, 27(1):93-98.

[12]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[13]陳澤斌, 夏振遠(yuǎn), 雷麗萍, 等. 煙草可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離及多樣性分析[J].微生物學(xué)通報(bào), 2011, 38(9):1347-1354.

[14]陳澤斌, 夏振遠(yuǎn), 雷麗萍, 等. 煙草黑脛病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分離、鑒定及防效測定[J]. 中國煙草學(xué)報(bào), 2011,17(6): 21-27.

[15]Devereux R, Hines M E, Stahl D A. S Cycling:Characterization of Natural Communities of Sulfate-Reducing Bacteria by 16S rRNA Sequence Comparisons [J].Microb Ecol, 1996, 32(3):283-292.

[16]Sambrook J. Molecular Cloning[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[17]Chun J, Lee J H, Jung Y, et al. EzTaxon: a web-based tool for the identi fication of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences [J]. IJSEM, 2007, 57:2259-2261.

[18]Andrew J H. Biological control in the phyllosphere[J]. Ann Rev Phytopathol,1992, 30:603-635.

[19]劉鳳英, 王淼, 孫勇娜, 等. 小麥紋枯病生防活性內(nèi)生細(xì)菌篩選[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(7): 3057-3058.

[20]Monica L E, Elizabeth A D J, William E B J, et al. Viability and stability of biological control Agents on cotton and snap bean seeds [J]. Pest Manag Sci，2001, 57:695-706.