徐紅艷，包怡紅*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

響應(yīng)面法優(yōu)化胡桃楸種仁殼總黃酮微波提取工藝

徐紅艷1,2，包怡紅1,*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

以胡桃楸種仁殼為原料，研究微波提取其總黃酮的最佳提取工藝條件。以總黃酮得率和總還原力為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率和微波時(shí)間為獨(dú)立變量，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化并得到回歸模型。結(jié)果表明：各變量影響主次順序?yàn)榱弦罕龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞微波功率＞微波時(shí)間；經(jīng)過優(yōu)化后的提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、料液比1:34(g/mL)、微波功率640W、微波時(shí)間13min，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)總黃酮得率為9.59mg/g，RSD為1.98%，該回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。提取液在7h內(nèi)總黃酮含量和總還原力基本保持穩(wěn)定。

胡桃楸；種仁殼；總黃酮；微波法；響應(yīng)面法

胡桃楸(Juglans mandshurica)系溫帶樹種，又名山核桃、楸樹，屬落葉喬木[1]，是古老而又重要的經(jīng)濟(jì)型樹種之一，其種仁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、氨基酸和不飽和脂肪酸[2]；木材優(yōu)良，材質(zhì)堅(jiān)硬致密，被廣泛用于軍工、建筑、樂器制造等方面[3]。胡桃楸藥用價(jià)值較高，研究表明，其根、葉、樹皮及青果皮等提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[4]，相關(guān)的化學(xué)成分研究也較為深入[5]，但關(guān)于種仁殼活性成分的具體研究還鮮見報(bào)道。黃酮類化合物是在植物中分布廣泛的天然產(chǎn)物，研究顯示具有多種藥理活性[6-7]，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒等，早已引起學(xué)者的廣泛關(guān)注[8-9]。響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)是通過多元二次回歸方程來擬合自變量因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并利用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果，從而優(yōu)化工藝參數(shù)的方法。目前已得到廣泛應(yīng)用[10-11]。

胡桃楸種子作為林業(yè)副產(chǎn)品，在種仁加工過程中，產(chǎn)生大量的種仁殼廢棄物，目前極少部分的種仁殼被加工成工藝品，多數(shù)做燒材。本實(shí)驗(yàn)以胡桃楸種仁殼為原料，采用微波法提取總黃酮，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，旨在為胡桃楸種仁殼的綜合開發(fā)利用及其活性成分的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

胡桃楸種子由黑龍江省牡丹江地區(qū)林業(yè)局提供。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純。

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WD800(MG-5531SD)微波爐 樂金電子(天津)電器有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法，按Huang Wuyang等[12]方法略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容50mL，配制質(zhì)量濃度為0.10mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，分別用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇補(bǔ)至3mL，再分別向各容量瓶中加5%的NaNO2溶液0.4mL，搖勻，靜置6min；加10%的Al(NO3)3溶液0.4mL，搖勻，靜置6min；最后加入1mol/L的NaOH溶液4mL，定容至刻度，放置20min，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)、以吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=13.536X－0.0005，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

1.2.2 總黃酮提取及得率測(cè)定

胡桃楸種仁殼粉碎，過60目篩。準(zhǔn)確稱取2.5g種仁殼粉，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下的料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，密封后室溫浸泡30min，進(jìn)行微波提取，再于55℃水浴30min，然后將提取液真空抽濾、減壓濃縮并定容至50mL。取1mL提取液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，按公式[13]計(jì)算得率：

1.2.3 Fe3＋總還原力的測(cè)定

按Wong等[14]采用鐵氰化鉀還原法并略有改動(dòng)。向試管中加入提取液2mL，再分別加入pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL、1%鐵氰化鉀2.5mL，混勻后密封50℃水浴20min，然后冰浴急速冷卻，再加入10%的三氯乙酸2.5mL，混勻并離心10min(4000r/min)。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水，再加入0.5mL三氯化鐵顯色，靜置10min，700nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1，以蒸餾水代替提取液為A0，F(xiàn)e3＋總還原力=A1－A0，A1－A0越大說明Fe3＋總還原力越強(qiáng)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以微波功率、微波時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為單因素，考察各單因素對(duì)胡桃楸種仁殼總黃酮得率和Fe3＋總還原力的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過Minitab 15軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15]，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率和微波時(shí)間4個(gè)因素為獨(dú)立變量，以總黃酮得率為響應(yīng)值。具體設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平編碼Table1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken design

1.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件，提取胡桃楸種仁殼總黃酮，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，考察響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件的重復(fù)性。

對(duì)制備的總黃酮提取液，每隔1h測(cè)總黃酮含量及總還原力，測(cè)定7次，考察提取液的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響

圖1 微波功率對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響Fig.1 Effect of microwave output power on total flavonoid yield and total reducing power

在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1:30、微波時(shí)間15min的條件下，微波功率對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)微波功率在160～640W時(shí)，隨著微波功率的增大，微波的作用逐漸加強(qiáng)，總黃酮得率和總還原力都逐漸增加，當(dāng)微波功率達(dá)640W時(shí)，達(dá)到最大，之后呈下降趨勢(shì)，可能是由于較大微波功率使種仁殼中的某些黃酮類成分遭到破壞，從而導(dǎo)致黃酮得率和總還原力有所下降。因此最佳微波功率為640W。

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響

圖2 微波時(shí)間對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響Fig.2 Effect of microwave irradiation time on total flavonoid yield and total reducing power

設(shè)定微波功率640W，其他條件同2.1.1節(jié)，微波時(shí)間對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響如圖2所示，隨著微波作用時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率緩慢增加，總還原力增加輻度大；當(dāng)微波時(shí)間為12min時(shí)，達(dá)最大值；之后隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率和總還原力都逐漸下降，可能是由于微波所產(chǎn)生的熱量長(zhǎng)時(shí)間作用于種仁殼，從而破壞了某些熱敏性黃酮類成分。因此最佳微波時(shí)間為12min。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on total flavonoid yield and total reducing power

設(shè)定微波時(shí)間12min、其他條件同2.1.2節(jié)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響如圖3所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮得率和總還原力增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，總黃酮得率和總還原力達(dá)最大；之后都逐漸下降，主要是由于高體積分?jǐn)?shù)乙醇更適合提取苷元類成分，而植物中的黃酮類物質(zhì)多是以黃酮苷的形成存在。因此選取最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.1.4 料液比對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響

圖4 料液比對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on total flavonoid yield and total reducing power

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，其他條件同2.1.3節(jié)，料液比對(duì)總黃酮得率和總還原力的影響如圖4所示，當(dāng)料液比在1:10～1:30時(shí)，總黃酮得率和總還原力都大輻度增加，這是因?yàn)樘崛∫河昧吭黾?，傳質(zhì)動(dòng)力增加；之后隨著提取液用量的增大，總黃酮得率和總還原力增加趨于緩慢。因此考慮經(jīng)濟(jì)效益，最佳料液比為1:30。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化種仁殼總黃酮提取工藝

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 響應(yīng)面分析優(yōu)化后模型的系數(shù)檢驗(yàn)Table3 Coefficients and their significance in the response surface equation

表4 響應(yīng)面優(yōu)化回歸方程的方差分析Table4 Analysis of variance for the response surface equation

根據(jù)表2進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果回歸擬合所得回歸模型如下：

由表3可知，相關(guān)系數(shù)R2=91.58%，線性項(xiàng)X2對(duì)黃酮得率影響極顯著(P≤0.01)，X1、X3和X4對(duì)黃酮得率影響顯著(P≤0.05)；平方項(xiàng)對(duì)黃酮得率影響均極顯著(P≤0.01)；但交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4對(duì)黃酮得率影響均不顯著(P＞0.05)。采用方差分析，分析回歸模型的顯著性及適應(yīng)性，結(jié)果見表4，響應(yīng)面回歸模型極顯著(P≤0.01)；模型失擬項(xiàng)P=0.202，不顯著(P＞0.05)，說明該二次模型可以較好地描述各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系，能夠擬合真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果。

綜合分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果可知，料液比對(duì)黃酮得率的影響最大，次之是乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率，微波時(shí)間影響較小。依據(jù)回歸模型確定最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55.21%、料液比1:33.6、微波功率679.07W、微波時(shí)間12.7min?；貧w模型預(yù)測(cè)的黃酮得率理論值為9.74mg/g。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，將上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、料液比1:34、微波功率640W、微波時(shí)間13min。以最佳工藝參數(shù)做3次平行實(shí)驗(yàn)，黃酮得率分別為9.59、9.63mg/g和9.54mg/g，平均得率為9.59mg/g，與理論預(yù)測(cè)值9.74mg/g相比，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)微波輔助提取胡桃楸種仁殼黃酮的提取效果。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of stability experiments

提取液室溫常規(guī)放置，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。在7h內(nèi)，總黃酮得率和總還原力變化差異不大，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.52%和0.64%，表明提取液在7h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本研究以響應(yīng)面法優(yōu)化胡桃楸種仁殼總黃酮微波提取工藝，各因素對(duì)總黃酮提取效果影響的主次順序是：料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率＞微波時(shí)間；經(jīng)過優(yōu)化后的提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、料液比1:34、微波功率640W、微波時(shí)間13min，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)總黃酮得率為9.59mg/g，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，證明響應(yīng)面法得到的胡桃楸種仁殼總黃酮提取條件是真實(shí)可靠的。經(jīng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，表明提取樣液在7h內(nèi)總黃酮含量和總還原力基本保持穩(wěn)定。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Total Flavonoids from Seed Shell of Juglans mandshurica Using Response Surface Methodology

XU Hong-yan1,2，BAO Yi-hong1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Agricultural College, Yanbian University, Yanji 133000, China)

The objective of this study was to establish the optimal conditions for microwave-assisted extraction of total flavonoids from seed shell of Juglans mandshurica. The extraction yield and total reducing power of total flavonoids were investigated as a function of independent variables including ethanol concentration, solid-to-liquid ratio, microwave output power and irradiation time by fitting a regression model. These variables were ranked in decreasing order of importance as solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, microwave output power and irradiation time. The optimized extraction conditions were found to be 55% ethanol as the extraction solvent with a solid-to-liquid ratio of 1:34 (g/mL) and microwave irradiation for 13 min with an output power of 640 W. The average extraction yield of total flavonoids obtained from validation experiments was 9.59 mg/g with RSD of 1.98% (n = 3), and the experimental data could be fitted with the developed regression model very well. Within 7 h, the total flavonoid content and total reducing power of the extract obtained remained substantially.

Juglans mandshurica；seed shell；total flavonoids；microwave-assisted extraction；response surface methodology

TS255.1

A

1002-6630(2013)18-0032-04

10.7506/spkx1002-6630-201318007

2012-07-06

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(LD09C14)

徐紅艷(1975—)，女，講師，博士研究生，主要從事天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與功能性食品研究。E-mail：hongyanxu122628@163.com

*通信作者：包怡紅(1970—)，女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與功能性食品研究。E-mail：baoyihong@163.com