曾興權(quán) 王玉林 徐齊君 原紅軍 尼瑪扎西

（1.西藏自治區(qū)青稞種質(zhì)改良和牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏拉薩850002；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏拉薩850002）

利用內(nèi)含子切接點(diǎn)引物分析西藏青稞種質(zhì)資源的遺傳多樣性

曾興權(quán)1，2王玉林1，2徐齊君1，2原紅軍1，2尼瑪扎西1，2

（1.西藏自治區(qū)青稞種質(zhì)改良和牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏拉薩850002；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏拉薩850002）

采用26條內(nèi)含子切接點(diǎn)引物（ISJ），對50份來自藏區(qū)的青稞育成品種、50份西藏近緣野生大麥、44份西藏青稞地方品種，共144份供試材料的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果分析表明，篩選利用22對多態(tài)較好的引物或引物組合對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增，不同引物或引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)變幅為3～12。144份材料間GS值變化變幅為0.06～0.96之間；群體內(nèi)的平均GS大小順序依次為，西藏青稞地方品種＞西藏近緣野生大麥＞藏區(qū)青稞育成品種；遺傳多樣性分析順序依次為西藏近緣野生大麥（1.5964）＞藏區(qū)青稞育成品種（1.5841）＞西藏青稞地方品種（1.1657）。對統(tǒng)計條帶并建立［1，0］矩陣，聚類與主坐標(biāo)分析表明，以144份材料的GS值0.40（L）為閾值，可將其劃分為七類。研究結(jié)果表明，同一來源地區(qū)的青稞育成品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，而不同地區(qū)間的藏區(qū)青稞育成品種遺傳差異較大；在進(jìn)行青稞超高產(chǎn)新品種選育時，應(yīng)充分發(fā)掘西藏近緣野生大麥和利用不同地域來源的育成品種，加強(qiáng)不同地區(qū)間資源的交換，以利于增加群體材料的遺傳多樣性和新品種的培育。

青稞；種質(zhì)資源；遺傳多樣性；內(nèi)含子切接點(diǎn)引物

中國青藏高原是栽培大麥的發(fā)源地，也是品種多樣性的重要地區(qū)，其中主要栽培的作物就是青稞。青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum HK.f.2n=14）又稱裸大麥，青藏高原在3 500年以前，青稞就作為西藏農(nóng)牧民主要的糧食作物和重要的畜牧飼料，而如今青稞同時作為健康產(chǎn)品和釀造業(yè)創(chuàng)造價值；青稞在西藏種植面積最大（青稞種植面積為21萬～22萬hm2），分布最廣（分布于全區(qū)28個農(nóng)業(yè)縣），品種類型最多［1］。

青藏高原生態(tài)類型繁多，不同區(qū)域降雨、溫度、土壤類型、植被和紫外線輻射各有不同，這賦予青稞具有高原極端條件下廣泛的適應(yīng)性和多樣性；同時，西藏農(nóng)業(yè)歷史悠久，最能適應(yīng)高原生態(tài)環(huán)境的青稞種質(zhì)資源極為豐富。從青藏高原及周邊地區(qū)不同的地理區(qū)域，大量的育成品種、地方品種和野生青稞品種被收集起來，顯示出豐富的形態(tài)和遺傳變異、生物脅迫耐受［2－4］。隨著人口增加、環(huán)境破壞、氣候變化，人類對糧食作物需求增加。而這些青稞品種勿庸置疑是豐富寶貴的基因資源，為基因的挖掘和作物改良提供條件。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是物種多樣性的基礎(chǔ)，在揭示物種或種群的進(jìn)化史的同時，使我們發(fā)現(xiàn)更豐富的遺傳資源，應(yīng)用于農(nóng)作物品種改良。

在已有的研究中，RFLP標(biāo)記、RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）標(biāo)記、AFLP標(biāo)記、SSR（Simple SequenceRepeats，SSR）標(biāo)記、ISSR標(biāo)記（Inter－Simple Sequence Repeat ISSR）等廣泛地應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析。內(nèi)含子在絕大多數(shù)植物中都存在，同時，外顯子與內(nèi)含子的結(jié)合區(qū)域高度保守，相對于外顯子，通常內(nèi)含子所受到的選擇壓力較弱，在不同物種甚至不同個體間，內(nèi)含子堿基序列和長度變異較大［16］。由于（intron－splice junction primer，ISJ）可根據(jù)內(nèi)含拼接位點(diǎn)設(shè)計正向引物和反向引物，而且引物間可以任意組合，已廣泛地應(yīng)用于動物、酵母、植物等遺傳多樣性研究中，均取得了很好的效果［17－19］。已有學(xué)者研究了高原地區(qū)青稞農(nóng)藝性狀［6］、貯藏蛋白［7－8，12］、RAPD［9］、SSR［2，10－11，13］、ISJ［14］、SRAP［15］。但是利用ISJ標(biāo)記分析西藏青稞地方種質(zhì)資源、西藏野生大麥群體、青藏區(qū)育成品種內(nèi)以及這幾個群體間的比較及關(guān)系研究報道較少。

本文利用ISJ標(biāo)記技術(shù)對西藏種質(zhì)資源不同類型群體的遺傳多樣進(jìn)行研究，探討這些資源群體內(nèi)和群體間的遺傳差異，明確西藏近緣野生大麥與西藏青稞地方品種、藏區(qū)青稞育成品種的關(guān)系，從資源角度對青稞種質(zhì)資源材料進(jìn)行綜合評價，以促進(jìn)豐富的青稞種質(zhì)資源在西藏青稞的高產(chǎn)、超高產(chǎn)育種與遺傳改良中的有效利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)共選取144份材料，其中由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供的藏區(qū)青稞育成品種50份、西藏青稞地方品種44份，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所提供的西藏近緣野生大麥50份。材料具體名稱見表1。

1.2 基因組DNA提取、引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測、數(shù)據(jù)分析

引物采用Song等［17］設(shè)計的ISJ引物，結(jié)合利用曾興權(quán)等［19］的設(shè)計的引物?；蚪MDNA提取、PCR反應(yīng)體系、電泳、照相及數(shù)據(jù)分析均參照曾興權(quán)等［19］的方法進(jìn)行。

表1 144份供試材料

續(xù)表1

表2 內(nèi)含子切接點(diǎn)引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)材料擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

本研究利用26條ISJ引物對供試材料進(jìn)行了多態(tài)性擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)中共得到50個多態(tài)性引物或引物組合，占篩選引物的25％。選取其中22對多態(tài)較好的引物或引物組合對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增。不同引物或引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)變幅為3～12，引物A1檢測出的等位變異最多，為12個等位變異，H11檢測出的等位變異最少，為3個等位變異。在西藏近緣野生大麥、西藏青稞地方品種、藏區(qū)青稞育成品種平均分別為5.8、5.5、5.7條。在西藏近緣野生大麥中能擴(kuò)增出127條穩(wěn)定清晰的條帶，多態(tài)性條帶比例（PPB）為94.8％；在西藏青稞地方品種能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的121條帶，PPB為90.3％；在藏區(qū)青稞育成品種能擴(kuò)增出125條穩(wěn)定清晰的條帶，PPB為93.3％；擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 西藏青稞種質(zhì)資源H8引物部分?jǐn)U增圖

2.2 不同種質(zhì)材料之間的遺傳相似性比較

依據(jù)144份材料PCR擴(kuò)增的結(jié)果構(gòu)建［1，0］矩陣，計算供試材料間的Dice遺傳相似系數(shù)（GS），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，144份材料間GS值變化變幅為0.06～0.96之間。其中來自西藏近緣野生的灰色野青稞與黑色野青稞間的GS值最大，遺傳相似程度最高。西藏青稞地方品種通路西卡蘭和格窮與西藏青稞育成品種藏青690之間的GS值最小，遺傳相似程度最低，因而遺傳距離最遠(yuǎn)。144份材料間GS值的變幅為0.06～0.96，平均為0.540 2；其中西藏近緣野生大麥材料間GS值的變幅為0.13～0.93平均為0.539 9；西藏青稞地方品種間的GS值變幅為0.64～0.96，平均為0.732 2；藏區(qū)青稞育成品種材料間GS值的變幅為0.08～0.87，平均為0.536 5。以上結(jié)果表明，群體內(nèi)的平均GS順序依次為，西藏青稞地方品種＞西藏近緣野生大麥＞藏區(qū)青稞育成品種。這些說明了西藏青稞地方品種比西藏近緣野生大麥與藏區(qū)青稞育成品種具有更高的GS值，遺傳相似程度較高，材料間遺傳距離也相應(yīng)較近；同時也表明藏區(qū)青稞育成品種和西藏近緣野生大麥群體內(nèi)部遺傳差異小于西藏青稞地方品種。

2.3 不同材料之間的遺傳多樣性比較及聚類分析

遺傳多樣性指數(shù)（H'）分析結(jié)果表明，144份材料的H'為1.684 8。其中西藏青稞地方品種材料群體的H'為1.165 7，西藏近緣野生大麥材料群體的H'為1.596 4，藏區(qū)青稞育成品種材料群體的H'為1.584 1。這些結(jié)果表明，西藏近緣野生大麥材料和藏區(qū)青稞育成品種材料的遺傳多樣性大于西藏青稞地方品種。

聚類分析表明，校驗(yàn)得到的符合系數(shù)為0.905 6，表明構(gòu)建的聚類圖與獲得的數(shù)據(jù)具有較好的符合度。聚類圖分析結(jié)果表明，以144份材料的平均遺傳相似系數(shù)0.40（L）為閾值，可將其劃分為七類。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)第I類有134份材料，其中青稞育成品種46份，西藏青稞地方品種38份，西藏野生大麥50份；第II類包括1份材料，為西藏青稞地方品種；第III類包括3份材料，全部為青稞育成品種；1份西藏青稞地方品種歸屬為第Ⅳ類；各2份西藏青稞地方品種分別歸屬為第Ⅴ、Ⅵ類；1份藏區(qū)青稞育成品種歸屬為Ⅶ。進(jìn)一步從主坐標(biāo)分析（圖2）表明，所得結(jié)果與聚類分析完全一致。

圖2 144份材料主要坐標(biāo)分析

3 討論

遺傳多樣性研究是作物遺傳育種的基礎(chǔ)，對西藏青稞種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究已成為重要課題之一。深入的研究藏區(qū)青稞育成品種、西藏青稞地方品種、西藏近緣野生大麥的遺傳多樣性，有利于發(fā)掘潛在的遺傳優(yōu)異基因資源。

吳昆侖［11］利用14對SSR引物研究認(rèn)為青藏高原青稞遺傳基礎(chǔ)較廣，蘊(yùn)藏著多種不同的等位基因，具有豐富的遺傳多樣性，可為青稞重要性狀遺傳特性、基因資源挖掘和品種選育等方面的研究提供參考。曾興權(quán)等［13］利用260對SSR引物對來自青藏高原的175份青稞種質(zhì)資的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明同一來源地區(qū)的青稞育成品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，不同地區(qū)間的青稞育成品種遺傳差異較大；在西藏青稞新品種選育和遺傳改良中，發(fā)掘和利用西藏野生大麥資源、西藏青稞地方品種資源的同時，更應(yīng)該加強(qiáng)不同地區(qū)青稞育成品種資源的交換和配合使用，有利于增加群體材料的遺傳多樣性和新品種的培育。潘志芬等［12］利用SSR標(biāo)記分析了64份青藏高原栽培青稞的遺傳多樣性，認(rèn)為青藏高原栽培青稞具有豐富的遺傳多樣性；楊平等［15］利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對25份來自四川高原的青稞育成品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明，材料聚類與其來源地有明顯的相關(guān)性；25份材料間的平均遺傳距離較小，平均遺傳多樣性較低，遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。張鏑等［20］采用AFLP標(biāo)記對西藏近緣野生大麥進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明西藏近緣野生大麥具有豐富的遺傳多樣性。汪愛華等［21］采用RAPD和ISSR標(biāo)記對110份青藏高原近緣野生大麥材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明西藏地區(qū)近緣野生大麥具有較高的遺傳多樣性。

本研究認(rèn)為，西藏青稞地方品種比西藏近緣野生大麥與藏區(qū)青稞育成品種具有更高的GS值，遺傳相似程度較高，材料間遺傳距離也相應(yīng)較近；同時也表明藏區(qū)青稞育成品種和西藏近緣野生大麥群體內(nèi)部遺傳差異小于西藏青稞地方品種；西藏近緣野生大麥的平均遺傳多樣性高于藏區(qū)青稞育成品種及西藏青稞地方品種的平均遺傳多樣性。本文的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了以往的研究［13］，同一來源地區(qū)的青稞育成品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄；不同地區(qū)間的青稞育成品種遺傳差異較大；我們在研究這些材料的醇溶蛋白遺傳多樣性時，也發(fā)現(xiàn)了此規(guī)律，青藏高原栽培青稞具有豐富的遺傳多樣性。在進(jìn)行青稞超高產(chǎn)新品種選育時，應(yīng)充分發(fā)掘西藏近緣野生大麥和利用不同地域來源的育成品種，加強(qiáng)不同地區(qū)資源的交換和配合使用，有利于增加群體材料的遺傳多樣性和新品種的培育［10－11，13］。

［1］胡頌杰.西藏農(nóng)業(yè)概論［M］.四川科學(xué)技術(shù)出版社，1995，144－145

［2］潘7志芬，鄒弈星，鄧光兵，等.青藏高原栽培青稞SSR標(biāo)記遺傳多樣性研究［J］.中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，46（2）：81－87

［3］Huaxin Dai，Wunian Shan，Jing Zhao，et al.Difference in response to aluminum stress among Tibetan wild barley genotypes［J］.Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2011，174（6），952－960

［4］Wang，C.P.Pan ZF，Nima ZX，etal.Starch granuleassociated proteins of hull－less barley（Hordeum vulgare L.）from the Qinghai－Tibet Plateau in China［J］.Journal of Sci.Food Agric.2011，91，616－624

［5］齊軍倉，張國平.大麥醇溶蛋白與麥芽品質(zhì)關(guān)系的研進(jìn)展［J］.麥類作物學(xué)報，2005，25（3）：115－118

［6］孟凡磊，趙亞斌，強(qiáng)小林，等.不同地區(qū)大麥品種農(nóng)藝性狀比較與西藏青稞品種改良［J］.麥類作物學(xué)報，2006，26（5）：175－177

［7］周洪金，劉新春，劉仙俊，等.川藏高原地區(qū)青稞育成品種醇溶蛋白遺傳多樣性的比較分析［J］.大麥與谷類科學(xué)，2007，（4）1－5

［8］劉新春，茍琳，楊平，等.青藏高原青稞品種醇溶蛋白的遺傳多樣性［J］.植物遺傳資源學(xué)報，2008，9（2）：180－185

［9］洪棋斌，侯磊，羅小英，等.應(yīng)用RAPD分析川西北高原青稞的遺傳背景［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34（2）：133－138

［10］楊菁，遲德釗，吳昆侖，等.青海省栽培青稞SSR標(biāo)記遺傳多樣性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（8）：4307－4309

［11］吳昆侖.青稞種質(zhì)資源的SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析［J］.麥類作物學(xué)報，2011，31（6）：1030－1034

［12］潘志芬，鄒弈星，鄧光兵，等.青藏高原青稞B組醇溶蛋白遺傳多樣性研究［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12（5）：601－604

［13］曾興權(quán)，王玉林，徐齊君，等.利用SSR引物分析西藏青稞種質(zhì)資源的遺傳多樣性［J］.麥類作物學(xué)報，2013，33（2）：260－267

［14］孟凡磊，強(qiáng)小林，佘奎軍，等.西藏主要農(nóng)區(qū)青稞品種的遺傳多樣性分析［J］.作物學(xué)報，2007（33）：1910－1914

［15］楊平，劉仙俊，劉新春，等.利用SRAP標(biāo)記研究四川高原青稞育成品種的遺傳多樣性［J］.遺傳，2008，30（1）：115—122

［16］Hawkins，J.D.A survey on intron and exon length.Nucleic Acidsy Research.1998，16：9893－9905

［17］Song Wei－Ning，Langridge P.Identification and mapping polymorphism in cereals based on polymerase chain reaction.Theor Appl Genet.1991（82）：209-216

［18］de Barros LM，Soden A，Henschke P A，Langridhe P.PCR differentiation of commercial yeast strains using intron splic site primers.Appl Environ Microbiol，1996，62：4514-4520

［19］Xingquan Zeng，Yajuan Wang，Weiyan Li，et al.Comparison of the genetic diversity between Triticum aestivum ssp.tibetanum Shao and Tibetan wheat landraces（Triticum aestivum L.）by using intron－splice junctionprimers［J］.Genet Resour Crop Evol，2010，57：1141-1150

［20］張鏑，丁毅.基于AFLP標(biāo)記的中國西藏近緣野生大麥遺傳多樣性分析［J］.遺傳，2007，29（6）：725－730

［21］汪愛華，丁毅.西藏近緣野生大麥RAPD和ISSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性［J］.武漢大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2007，53（6）：723－730

Assessment of Genetic Diversity of Tibetan Hulless Barley Germ plasm（Hordeum vulgare L.）by ISJ Primers

ZENG Xing－quan1，2WANG Yu－lin1，2XU Qi－jun1，2YUAN Hong－jun1，2NIMazhaxi1，2
（1.Barley Improvement and Yak Breeding Key Laboratory of Tibet Autonomous Region，LhaSa 850002，China；2.Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850002，China）

In order to assess the rich Tibetan Hulless barley germplasm in Tibet，we analyzed the genetic diversity of144 Hulless barley varieties，including 50 Tibetan bred barley materials，50 wild relatives of barley materials，and 44 Tibet highland barley landrace varieties by 26 introns splice junction（ISJ）primers.The results showed that there were 22 primerswith high polymorphism outof26 ISJ primers，bands ranged from 3 to 12 and the GS values ranged from 0.06 to 0.96 among the 144 materials.The average size of GS sequence in different population of hulless barleys was Tibet highland barley landrace varieties＞wild relatives barley＞Tibetan bred barley.The results of those analyses on the genetic diversity indicated thatwild relatives of barley varieties（1.5964）＞Tibetan bred barley（1.5841）＞Tibet highland barley landrace varieties（1.1657）.Clustering and main coordinate analysis showed that when the threshold value GS=0.40，experimentalmaterials were divided into 7 big groups by establishing matrix［0，1］.The results showed that Tibetan bred barley with the same source area were narrow genetic basis，otherwise Tibetan bred barley with the different source area were genetic difference；in our future barley breeding work，it is necessary to explore the wild relatives of barley resource and the differentgeographical origin of bred barley varieties.Strengthen the exchange among resources，and increase the genetic diversity of breedingmaterials and new varieties.

Tibetan hulless barley；Germplasm；Genetic diversity；ISJprimer

2013－07－21

973計劃前期研究專項（2011CB111512；2012CB723006）；國家科技支撐計劃（2012BAD03B01）。

曾興權(quán)（1975－），男，博士，副研究員。主要從事青稞遺傳育種工作。