劉平懷，張 玲，羅 寧

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228）

單針藻（Monoraphidium sp.）是具有較高的科研及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微藻，有著極大地應(yīng)用潛力。研究發(fā)現(xiàn)，單針藻是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良藻株[1-3]，亦可用來(lái)生產(chǎn)蝦青素[4]。單針藻細(xì)胞為不規(guī)則的寬紡錘形，呈直或略彎，細(xì)胞寬約4～8μm，長(zhǎng)約12～26μm，由于其特殊的微小個(gè)體，采用傳統(tǒng)的固液分離方法會(huì)堵塞濾膜而使得過(guò)濾失效；另外，微藻細(xì)胞懸浮于水中無(wú)法自然沉降，且在開(kāi)放培養(yǎng)體系中濃度很低（一般為0.5～3g/L）[5]，極大地增加了離心收集的成本。有研究表明，微藻的采收成本占其生產(chǎn)成本的20%～30%[6]，因此尋找高效的采收技術(shù)以降低微藻培養(yǎng)成本十分重要，國(guó)內(nèi)外通常采用的方法是將微藻培養(yǎng)液濃縮。在藻液中添加絮凝劑是微藻采收過(guò)程中常用的一種技術(shù)[7]，常用的絮凝劑包含無(wú)機(jī)和有機(jī)試劑，如硫酸鋁、硫酸鋁鉀、氫氧化鈣、聚合氯化鋁、聚丙烯酰胺和殼聚糖等。目前國(guó)內(nèi)外較少報(bào)道關(guān)于單針藻的絮凝采收。本文考察了硫酸鋁鉀、硫酸鋁、氫氧化鈣、氯化鐵、氯化鋁、聚丙烯酰胺、殼聚糖7種試劑對(duì)單針藻的絮凝效應(yīng)，以期找到適合單針藻濃縮的絮凝劑，為單針藻采收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單針藻（Monoraphidium sp.） 分離自海南儋州，現(xiàn)保存于海南大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室；硫酸鋁鉀（KA l（SO4）2，AR，純度＞99.5%）、氫氧化鈣（Ca（OH）2， AR，純度＞95.0%）、聚丙烯酰胺（AR，純度＞90.0%）天津永大化學(xué)試劑；硫酸鋁（Al2（SO4）3，AR，純度＞99.0%）、氯化鐵（FeCl3，AR，純度＞99.0%）、氯化鋁（AlCl3，AR，純度＞97.0%） 廣州化學(xué)試劑；殼聚糖BR，脫乙酰度80.0%～95.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑。

CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)日立；LGJ-25C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)儀器；IX71型倒置顯微鏡 奧林帕斯；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 普析通用。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

單針藻培養(yǎng)采用BG-11液體培養(yǎng)基（參照美國(guó)德州大學(xué)藻種庫(kù)配方），100L大桶通氣培養(yǎng)，大桶置于室外陽(yáng)臺(tái)，培養(yǎng)10d后取藻液，8000r/min離心，收集藻泥，冷凍干燥機(jī)凍干，藻粉存儲(chǔ)于-20℃冰箱備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單針藻藻體干重與光密度值的關(guān)系

1.3.1.1 單針藻最大吸收波長(zhǎng)的確定 稱(chēng)取一定量的單針藻藻粉，用蒸餾水配制成濃度為0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000g/L的藻液，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)做全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)光密度值確定其在不同濃度下的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.1.2 單針藻藻體干重與光密度值標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 取單針藻藻粉，用蒸餾水配制成濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6g/L，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，依據(jù)吸光度值繪制藻體干重與光密度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=a x+b，其中x為藻體干重，y為吸光度值。

1.3.2 不同絮凝劑對(duì)單針藻絮凝效率的研究 本次實(shí)驗(yàn)共采用7種絮凝劑，分別為：KA l（SO4）2、A l2（SO4）3、Ca（OH）2、FeCl3、A lCl3、聚丙烯酰胺、殼聚糖。取絮凝劑以0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L七種濃度，添加到單針藻藻液中（OD680值約為2.5），其中殼聚糖組使用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.5?；旌弦貉杆贁嚢钄?shù)秒，每隔一段時(shí)間測(cè)定吸光度值，每組設(shè)置2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，以絮凝效率衡量，計(jì)算公式如下：

絮凝效率（%）=（y0-yt）/（y0-b）×100

式中，y0為單針藻藻液的初始吸光度值，yt為時(shí)間t測(cè)得藻液吸光度值，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=ax+b）中截距b。

1.3.3 絮凝劑對(duì)單針藻細(xì)胞破壞程度的研究 取單針藻絮凝層，加入到24微孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用倒置顯微鏡觀(guān)察單針藻細(xì)胞絮凝狀態(tài)，考察不同絮凝劑對(duì)單針藻細(xì)胞破壞程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單針藻藻體干重與光密度值的關(guān)系

不同濃度的單針藻藻液全波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，在濃度為0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000g/L下，單針藻藻液最大吸收波長(zhǎng)均為680nm，這一結(jié)果與目前大部分文獻(xiàn)中微藻培養(yǎng)檢測(cè)所采用的波長(zhǎng)一致，由此可以確定單針藻培養(yǎng)過(guò)程中的檢測(cè)波長(zhǎng)為680nm。

由單針藻藻體干重與光密度值的關(guān)系所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示，由圖2可知，在藻液濃度為0.05～1.2g/L的范圍內(nèi)，單針藻藻體干重與吸光度值存在線(xiàn)性關(guān)系，即，y=2.06x+0.201，R2=0.9814。因此，在此濃度范圍內(nèi)可根據(jù)所測(cè)得的吸光度值計(jì)算藻液中藻體干重。

圖1 單針藻500～900nm下波譜掃描Fig.1 Spectrum of the absorbency of different concentrations of Monoraphidium sp.at differentwavelength

圖2 藻體干重與吸光度值的關(guān)系Fig.2 Relation of cell dry weight and OD680

2.2 不同絮凝劑對(duì)單針藻絮凝效率的研究

圖3 KA（l SO4）2對(duì)單針藻絮凝效率Fig.3 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with aluminium potassium sulfate

2.2.1 KA l（SO4）2對(duì)單針藻的絮凝效率研究 如圖3所示，KAl（SO4）2對(duì)單針藻的絮凝效率隨濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)KAl（SO4）2濃度為0.1～0.6g/L時(shí)，絮凝效果不明顯，330m in后絮凝效率仍低于30%；當(dāng)KA l（SO4）2濃度為0.8g/L時(shí)，280m in后55%以上的藻體絮凝；當(dāng)KAl（SO4）2濃度為1.0g/L時(shí)，20min后40%以上的藻體絮凝，280m in后65%以上的藻體絮凝。KA l（SO4）2對(duì)不同微藻絮凝效率不同，對(duì)銅綠微球藻和牟氏角毛藻絮凝效率較高，而對(duì)湛江等鞭金藻絮凝效率較差[8]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度的KAl（SO4）2對(duì)單針藻具有較好的絮凝效率，但消耗大量KA l（SO4）2會(huì)極大增加微藻生產(chǎn)成本，因此，KAl（SO4）2不適合用于單針藻大規(guī)模培養(yǎng)絮凝采收。

2.2.2 A l2（SO4）3對(duì)單針藻的絮凝效率研究 如圖4所示，A l2（SO4）3對(duì)單針藻的絮凝效率較高，隨著濃度的增加絮凝效果較為明顯。Al2（SO4）3濃度低于0.2g/L時(shí)，280m in后60%以上藻體絮凝；當(dāng)A l2（SO4）3濃度大于0.4g/L時(shí)，單針藻藻體絮凝較快，10m in后70%以上的藻體絮凝，25m in后藻體完全絮凝。作為一種常用的無(wú)機(jī)絮凝劑，Al2（SO4）3在絮凝采收小球藻[9]、球等鞭金藻[10]、微綠球藻和三角褐指藻[11]等微藻時(shí)均獲得了較好的效果。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A l2（SO4）3對(duì)單針藻具有較好的絮凝效果，可用于單針藻的絮凝采收。

圖4 Al2（SO4）3對(duì)單針藻絮凝效率Fig.4 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with aluminum sulfate

圖5 Ca（OH）2對(duì)單針藻絮凝效率Fig.5 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with calcium hydroxide

2.2.3 Ca（OH）2對(duì)單針藻的絮凝效率研究 如圖5所示，Ca（OH）2對(duì)單針藻的絮凝效率較低，其絮凝效率隨濃度的增加而增大。當(dāng)Ca（OH）2濃度低于0.6g/L時(shí)，240min后藻體絮凝效率低于20%，當(dāng)Ca（OH）2濃度為0.8g/L時(shí)，20m in后有45%的藻體絮凝，但隨著時(shí)間的增加剩余藻體未絮凝；當(dāng)Ca（OH）2濃度為1.0g/L時(shí)，240m in后有70%的藻體絮凝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低濃度Ca（OH）2對(duì)單針藻絮凝效率低，高濃度的Ca（OH）2能夠較好的絮凝單針藻，但由于Ca（OH）2濃度過(guò)高不僅會(huì)增加采收成本，還會(huì)極大增加藻液pH進(jìn)而破壞藻體，因此不適合用于單針藻絮凝采收。

2.2.4 FeCl3對(duì)單針藻的絮凝效率研究 如圖6所示，在FeCl3濃度低于0.4g/L的條件下，單針藻的絮凝效率隨濃度的增加而增大，但FeCl3濃度高于0.6g/L時(shí)，絮凝效率下降。當(dāng)FeCl3濃度為0.1g/L時(shí)，藻體10m in后即能絮凝40%，且隨著時(shí)間增加藻體基本不再絮凝；當(dāng)FeCl3濃度為0.2～0.4g/L時(shí)，絮凝效果較好，25m in即能絮凝95%以上藻體，50min后藻體完全絮凝；當(dāng)FeCl3濃度為0.6g/L時(shí)，絮凝效率下降，僅為80%，當(dāng)濃度增加到0.8～1.0g/L時(shí)，絮凝效果不明顯，藻體在240m in后絮凝效率仍低于40%。絮凝劑過(guò)多不僅會(huì)破壞藻細(xì)胞，而且會(huì)使藻液中正電荷增多，過(guò)量的正電荷在系統(tǒng)中相互排斥，進(jìn)而影響絮凝效果[9，12]。

圖6 FeCl3對(duì)單針藻絮凝效率Fig.6 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with ferric chloride

2.2.5 AlCl3對(duì)單針藻的絮凝效率研究 如圖7所示，A lCl3對(duì)針藻的絮凝效率和FeCl3類(lèi)似，隨A lCl3濃度的增加而增大，但過(guò)高的濃度會(huì)影響藻體的絮凝。當(dāng)A lCl3濃度為0.1g/L時(shí)，藻體僅能絮凝25%；當(dāng)A lCl3濃度為0.2g/L時(shí)，藻體僅能絮凝45%；當(dāng)AlCl3濃度為0.4～0.8g/L時(shí)，藻體在20min后能完全絮凝；當(dāng)AlCl3濃度增加到1.0g/L時(shí)，藻體基本不絮凝。

圖7 AlCl3對(duì)單針藻絮凝效率Fig.7 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with aluminum chloride

2.2.6 聚丙烯酰胺對(duì)單針藻的絮凝效率研究 由圖8可知，聚丙烯酰胺對(duì)單針藻幾乎無(wú)絮凝作用。不同濃度下，藻液的沉降效果無(wú)明顯差異，240m in后藻體基本不絮凝。

2.2.7 殼聚糖對(duì)單針藻的絮凝效率研究 采用濃度梯度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L的殼聚糖在pH=5.5的情況下絮凝單針藻，結(jié)果顯示，當(dāng)濃度大于0.1g/L時(shí)，15m in后單針藻能夠完全絮凝。為考察殼聚糖最佳用量，設(shè)置濃度梯度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g/L，結(jié)果如圖9所示，當(dāng)殼聚糖濃度為0.01g/L時(shí)，絮凝效率僅為10%；當(dāng)濃度為0.02、0.03g/L時(shí)，最終絮凝效率為70%；當(dāng)濃度為0.04、0.05g/L時(shí)，15m in后絮凝效率為100%。由此可見(jiàn)，殼聚糖的最佳用量為0.04g/L。殼聚糖作為一種天然高分子化合物，生物相容性好，無(wú)毒，能夠生物降解，不會(huì)造成2次污染，使用殼聚糖采收的微藻可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和能源行業(yè)[13]，利用殼聚糖絮凝采收微藻后上清液可以再次利用培養(yǎng)微藻[14]。研究證實(shí)，殼聚糖在收集微藻中取得較好的效果[15-16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示殼聚糖有望用作單針藻大規(guī)模培養(yǎng)采收絮凝濃縮試劑。

圖8 聚丙烯酰胺對(duì)單針藻絮凝效率Fig.8 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with polyacrylamide

圖9 殼聚糖對(duì)單針藻絮凝效率Fig.9 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with chitosan

2.3 絮凝劑對(duì)單針藻細(xì)胞完整性的影響

由不同絮凝劑對(duì)單針藻絮凝效率的研究可知，不同絮凝劑（聚丙烯酰胺除外）對(duì)單針藻的絮凝都有最適的絮凝濃度，本實(shí)驗(yàn)選取各絮凝劑的最適濃度和（或）最高濃度進(jìn)行細(xì)胞完整性實(shí)驗(yàn)。取絮凝層藻液加入細(xì)胞培養(yǎng)板，采用倒置顯微鏡觀(guān)察，考察不同絮凝劑對(duì)單針藻細(xì)胞破壞程度，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，Ca（OH）2對(duì)單針藻細(xì)胞破壞較嚴(yán)重，部分藻細(xì)胞破裂，藻液中出現(xiàn)較小的碎片（圖10d）。藻液中添加KA l（SO4）2、A l2（SO4）3后，單針藻細(xì)胞形成較大的絮凝塊，大部分細(xì)胞保持較好的完整性（圖10b～c）。向單針藻藻液中添加0.2g/L的FeCl3后，細(xì)胞絮凝較為明顯，細(xì)胞損傷較?。▓D10e）；當(dāng)FeCl3濃度為1.0g/L，藻細(xì)胞呈均勻分散，細(xì)胞完整性較好，但藻細(xì)胞基本不絮凝（圖10f）；單針藻細(xì)胞在高、低濃度FeCl3中呈現(xiàn)不同的絮凝狀態(tài)，可能原因是低濃度的FeCl3能夠通過(guò)吸附架橋和網(wǎng)捕沉淀作用使單針藻細(xì)胞形成較大的絮凝塊而沉淀，但過(guò)高濃度的FeCl3（＞0.6g/L）引入過(guò)量正電荷形成了較為均勻的分散體系而使得藻細(xì)胞無(wú)法絮凝。添加0.4g/L的AlCl3后，藻細(xì)胞形成較大的絮凝塊，當(dāng)A lCl3濃度增加到1.0g/L時(shí)，絮凝塊變小，且細(xì)胞出現(xiàn)脫水（圖10g～h），由此可見(jiàn)，高濃度的A lCl3會(huì)對(duì)單針藻細(xì)胞產(chǎn)生破壞而影響其絮凝效果。添加聚丙烯酰胺后細(xì)胞基本不絮凝，細(xì)胞形態(tài)也未受到影響（圖10i）。添加殼聚糖后，單針藻細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的整體絮凝塊，細(xì)胞基本無(wú)損壞（圖10j）。從絮凝劑對(duì)細(xì)胞破壞程度來(lái)看，采用殼聚糖絮凝采收單針藻對(duì)藻細(xì)胞影響較小，因此，選擇殼聚糖為最佳絮凝劑。

圖10 絮凝劑對(duì)單針藻細(xì)胞完整性的影響（×400）Fig.1 0 Effectof flocculants on Monoraphidium sp.cell integrity（×400）

3 結(jié)論

在所選7種試劑中，殼聚糖為單針藻濃縮采收的最佳試劑，當(dāng)殼聚糖用量為0.04g/L時(shí)，15m in即能達(dá)到100%的絮凝效率，顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)殼聚糖基本不破壞單針藻細(xì)胞。本次實(shí)驗(yàn)殼聚糖的最低用量高于其他文獻(xiàn)[14，17]，分析原因可能是藻種不同從而導(dǎo)致絮凝效率不同。對(duì)殼聚糖絮凝單針藻的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，減少其用量，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本將是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)聚丙烯酰胺對(duì)單針藻細(xì)胞基本無(wú)絮凝作用。KAl（SO4）2和Ca（OH）2對(duì)單針藻絮凝效率較低，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)隨著絮凝劑用量增加絮凝效率增加，當(dāng)絮凝劑用量為1.0g/L時(shí)，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)間內(nèi)絮凝效率僅能達(dá)到70%；KA l（SO4）2對(duì)單針藻細(xì)胞損害較小，Ca（OH）2對(duì)單針藻細(xì)胞有較大的破壞。A l2（SO4）3、FeCl3、A lCl3絮凝效果較好，當(dāng)用量分別為0.4、0.2、0.4g/L時(shí)，即能達(dá)到100%的絮凝效率，但過(guò)量的FeCl3、A lCl3反而不利于單針藻的絮凝；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Al2（SO4）3、FeCl3對(duì)單針藻細(xì)胞損傷較小，高濃度的A lCl3（1.0g/L）會(huì)破壞單針藻細(xì)胞。

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