歐秀瓊，景紹紅，黃 萍，宋 凡，張曉春，葛良鵬

(重慶市畜牧科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，重慶402460)

在肉制品生產(chǎn)中，亞硝酸鹽是傳統(tǒng)的發(fā)色劑和防腐劑，還能使肉制品產(chǎn)生特有的風(fēng)味和組織結(jié)構(gòu)。但如果加入量過多、攪拌不均勻或者加工工藝不合理，就非常容易導(dǎo)致成品中亞硝酸鹽殘留量過高，造成食物中毒，此外，肉制品中殘留的亞硝酸鹽與人體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物反應(yīng)會(huì)生成致癌物質(zhì)，正是由于亞硝酸鹽對(duì)人體的這些危害作用，多年來各國科學(xué)家一直在尋找它的有效替代品，因此部分或全部替代亞硝酸鹽的研究受到了廣泛的關(guān)注。由于亞硝酸鹽的發(fā)色原理是亞硝基與肌紅蛋白亞鐵離子形成六配位復(fù)合物亞硝基肌紅蛋白，因此一般都是將血紅蛋白進(jìn)行亞硝基化得到櫻桃紅色的亞硝基血紅蛋白作為發(fā)色劑添加到肉制品中。不少研究工作者已相繼開展了亞硝基血紅蛋白替代亞硝酸鹽的研究，也取得了一定的研究結(jié)果［1-4］，但依然存在亞硝酸鹽殘留問題，同時(shí)亞硝基血紅蛋白類色素的穩(wěn)定性較差，限制了血紅蛋白類色素的使用，因此生產(chǎn)具有穩(wěn)定性和分散性更好的無硝血紅蛋白將是未來發(fā)展的方向。已有的研究表明，煙酰胺、D-異抗壞血酸鈉和糖類對(duì)于維持血紅蛋白分子結(jié)夠的穩(wěn)定性均有一定的作用［5］，且這些物質(zhì)都是目前食品工業(yè)允許使用的食用添加劑，因此本研究以亞硝基血紅蛋白作為對(duì)照，系統(tǒng)研究煙酰胺、D-異抗壞血酸鈉和糖類復(fù)配作用對(duì)于血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響，包括溫度、光照、金屬離子及pH等影響因素，旨在探索一種不含亞硝酸鹽的天然色素，從而替代或部分替代肉制品中亞硝酸鹽的使用，一方面降低肉制品中亞硝酸鹽的殘留量，另一方面提高畜產(chǎn)品的綜合利用價(jià)值，產(chǎn)生較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬血 采自榮昌縣屠宰場;檸檬酸三鈉、丙三醇(甘油) 分析純;煙酰胺、D-異抗壞血酸鈉、水溶性殼聚糖、亞硝酸鈉 均為食品級(jí)。

FA2004A電子天平 上海精天電子儀器廠; FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH系列恒溫水浴鍋 江蘇金壇中大儀器廠;TDL-50B低速臺(tái)式大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FD-1B-50型冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 新型血紅蛋白色素的制備 采集豬血，常規(guī)抗凝處理，4～8層紗布過濾抗凝后的血液，除去雜質(zhì)顆粒，裝入透明容器，于4℃條件下靜置4～8h，血漿和血細(xì)胞發(fā)生自然沉降分離。傾去上層血漿后，然后加入等體積的蒸餾水，充分?jǐn)嚢枋寡?xì)胞破壁，釋放出血紅蛋白。加入終濃度為10mg/m L的甘油，充分?jǐn)嚢?，棕色磨口瓶分裝于4℃條件保存?zhèn)溆?。在血紅蛋白液中加入1%煙酰胺和1%D-異抗壞血酸鈉，攪拌均勻后于4℃避光反應(yīng)24h，再與0.5%水溶性殼聚糖1∶1混合，在50℃條件下加熱5m in，去除未反應(yīng)、變性的蛋白質(zhì)，冷凍干燥得新型血紅蛋白色素。

1.2.2 亞硝基血紅蛋白的制備 參照楊錫洪等［6］方法，于1000m L血紅蛋白液中加入0.8g亞硝酸鈉和3.6g D-異抗壞血酸鈉，攪拌均勻后調(diào)pH為6.1，于4℃避光反應(yīng)24h，冷凍干燥得亞硝基血紅蛋白發(fā)色劑。

1.2.3 新型血紅蛋白色素的穩(wěn)定性研究

1.2.3.1 對(duì)熱穩(wěn)定性研究 將制備的新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白凍干樣品配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%水溶液，于恒溫水浴鍋中在70℃條件下分別加熱10、20、30min，冷卻后離心，取上清稀釋20倍過濾，觀察顏色并于540nm處測吸光值。

1.2.3.2 對(duì)光穩(wěn)定性研究 取新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白凍干樣品(2g左右)于試管中并密封，分別置于室內(nèi)自然光及室內(nèi)黑暗自條件下觀察色澤變化情況，每隔1周各取0.100g，溶解于50m L蒸餾水中，然后過濾，觀察顏色并于波長540nm處測吸光度A。

1.2.3.3 對(duì)金屬離子穩(wěn)定性研究 分別取0.5g新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白凍干樣品加入10m L濃度為0.1mol/L的五水硫酸銅、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鋅、氫氧化鎂、氯化鉀、氯化鈣溶液混勻，黑暗處放置一定時(shí)間后(顏色發(fā)生變化時(shí))，離心，取上清稀釋20倍過濾，觀察顏色并于540nm處測吸光度A。

1.2.3.4 對(duì) pH穩(wěn)定性的研究 用1mol/L HCl和0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié)不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液10m L，分別加入0.5g血紅蛋白凍干樣品，室內(nèi)光照放置一定時(shí)間后(顏色發(fā)生變化時(shí))，離心，取上清稀釋20倍過濾，觀察顏色并于540nm處測吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響如圖1所示。

選取低溫肉制品加工溫度作為新型血紅蛋白色素?zé)岱€(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)溫度。由圖1可見，隨著加熱時(shí)間的延長，新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白的吸光值均呈下降趨勢，在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，新型血紅蛋白色素吸光值極顯著高于亞硝基血紅蛋白的吸光值(p＜0.01)，表明新型血紅蛋白色素在低溫肉制品加工中對(duì)熱穩(wěn)定性要優(yōu)于亞硝基血紅蛋白。

圖1 溫度對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on stability of novel hemoglobin pigment

2.2 光照對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

2.2.1 室內(nèi)自然光線對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響 室內(nèi)自然光線對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響如圖2所示。

圖2 自然光對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of natural light on stability of novel hemoglobin pigment

由圖2可見，在室內(nèi)自然光條件下，隨著貯藏時(shí)間的增加，新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白的吸光度均呈下降趨勢，但在各個(gè)時(shí)間階段，新型血紅蛋白色素的吸光度均極顯著高于亞硝基血紅蛋白(p＜0.01)，表明新型血紅蛋白色素對(duì)光的穩(wěn)定性要優(yōu)于亞硝基血紅蛋白。

2.2.2 室內(nèi)黑暗條件下對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響 室內(nèi)黑暗條件下對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響如圖3所示。

由圖3可見，在室內(nèi)黑暗條件下，新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白隨著貯藏時(shí)間的延長，吸光度呈下降趨勢，但各儲(chǔ)藏階段糖基化無硝血紅蛋白的吸光值均高于亞硝基血紅蛋白，且各階段的二者吸光值均高于自然光照組(p＜0.01)，表明在黑暗條件下的儲(chǔ)藏條件要優(yōu)于自然光照條件。

2.3 金屬離子對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

金屬離子對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響如圖4所示。

由圖4可見，Cu2+、Fe2+、Zn2+對(duì)新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白的影響均較大，加入 Cu2+、 Fe2+、Zn2+后吸光度非常低，而Mg2+、K+、Ca2+對(duì)新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白的影響較小，在相同條件下，除銅離子無差異顯著外，新型血紅蛋白色素對(duì)其余金屬離子的穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于亞硝基血紅蛋白(p＜0.01)。

圖3 黑暗條件對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Stability of novel hemoglobin pigment in dark

圖4 金屬離子對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of iron on stability of novel hemoglobin pigment

2.4 pH對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

pH對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響如圖5所示。

由圖5可見，新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白經(jīng)不同pH緩沖液處理后，其吸光度均無明顯變化，但總的趨勢是新型血紅蛋白色素吸光度高于亞硝基血紅蛋白，除pH6.0條件下，二者無顯著性差異，其余pH條件下，新型血紅蛋白色素吸光度極顯著高于亞硝基血紅蛋白(p＜0.01)。表明兩者在pH5～8范圍內(nèi)均較穩(wěn)定。

圖5 pH對(duì)新型血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on stability of novel hemoglobin pigment

3 結(jié)論

新型血紅蛋白色素對(duì)溫度、光照、金屬離子的穩(wěn)定性總體上均優(yōu)于亞硝基血紅蛋白，但光照以及Cu2+、Fe2+、Zn2+對(duì)新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白的影響均較大，而pH5～8范圍內(nèi)對(duì)新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白均無明顯影響。

［1］Shahidi F，Rubin L.Preparation of the cooked cured meat pigment，dinitrosyl ferrohemochrome from hemin and nitric oxide［J］.Journal of Food Science，1985，50(1):272-273.

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［3］楊錫洪，夏文水.糖基化亞硝基血紅蛋白色素在灌腸中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26(4):100-102.

［4］黃群，馬美湖，麻成金，等.亞硝基血紅蛋白合成研究［J］.肉類工業(yè)，2007，309(1):28-31.

［5］Leo ML Nollet，F(xiàn)idel Toldr.Processing of nitrite-free cured meats，Advanced Technologies For Meat Processing［M］.CRC Press 2006，309-327.ISBN:978-1-57444-587-9.

［6］楊錫洪，解萬翠，王維民，等.穩(wěn)定性色素—糖基化亞硝基血紅蛋白的研制［J］.食品科學(xué)，2007，28(10):204-207.