劉生峰，肖進(jìn)文，周蓓莉，楊 俊，聶福平，王 昱，周 慶，李應(yīng)國(guó)

(1.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶400020; 2.重慶市進(jìn)出口食品安全工程研究中心，重慶400020; 3.西南大學(xué)，重慶400715)

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是指催化酯酰甘油水解的一類酶的總稱，是一類特殊的酯鍵水解酶，其天然底物是長(zhǎng)鏈脂肪酸酯，既可以在兩相系統(tǒng)(油、水界面)中起作用，也可以在水相中起作用。脂肪酶作為生物催化劑可催化由不同底物出發(fā)的水解和合成反應(yīng)，且反應(yīng)不需要輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。因此，脂肪酶的應(yīng)用十分廣泛，如食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、化學(xué)化工、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。微生物來(lái)源的脂肪酶具備廣泛的pH、溫度范圍以及底物專一性，是工業(yè)用脂肪酶研究的熱點(diǎn)。地衣芽孢桿菌(B.licheniform is)是一種革蘭氏陽(yáng)性腐生性微生物，在自然界分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，它可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類和核酸類物質(zhì)。地衣芽孢桿菌具有耐熱、酶系豐富、產(chǎn)酶量更高和安全等諸多優(yōu)良特性，被認(rèn)為是較理想的工業(yè)生產(chǎn)菌株［1］，與枯草芽孢桿菌相比，地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)溫度高5～7℃，地衣芽孢桿菌所分泌的酶系成為工業(yè)酶制劑的重要來(lái)源，其模式菌株的基因組序列也于2004年公布［2-3］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于地衣芽孢桿菌應(yīng)用的報(bào)道日益增多，尤其在醫(yī)藥、飼料加工、農(nóng)藥等行業(yè)地衣芽孢桿菌已得到廣泛的應(yīng)用。地衣芽孢桿菌的功能基因，如纖維素酶［4］、β-甘露聚糖酶［5］、葡聚糖酶［6-7］、蛋白酶［8-10］、α淀粉酶［11-13］、亮氨酸脫氫酶［14］、堿性果膠酶［15］、植酸酶［16］、γ-聚谷氨酸降解酶［17］等都得到了克隆表達(dá)。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的一株芽孢桿菌進(jìn)行初步鑒定并對(duì)其脂肪酶基因LIP進(jìn)行克隆和序列分析，為進(jìn)一步構(gòu)建工程菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢桿菌菌株BL03 由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏;大腸桿菌(Escherichia coli)JM109 由本實(shí)驗(yàn)室保藏;質(zhì)粒載體pMD19-T、PCR擴(kuò)增試劑、膠回收試劑盒和載體連接試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、芽孢染色試劑和革蘭氏染色試劑 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;LB培養(yǎng)基 英國(guó)OXOID公司;芽孢桿菌生化鑒定卡 生物梅里埃公司;DNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;引物 生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

BX51型熒光正置相差顯微鏡日本OLYMPUS公司;全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)-VITEK 32生物梅里埃公司;Mycycler核酸擴(kuò)增儀和電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司;200E型凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)SIM公司;IPP500型低溫培養(yǎng)箱 德國(guó)MEMMERT公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株鑒定 將菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，37℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后鏡檢，觀察其菌體形態(tài)。生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［18］，用全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)-VITEK 32對(duì)菌株進(jìn)行鑒定［19］。

1.2.2 LIP基因的PCR擴(kuò)增 用細(xì)菌核酸提取試劑盒提取菌株BL03的基因組，用做PCR擴(kuò)增的模板。根據(jù)GenBank中報(bào)道的B.licheniform is(ATCC 14580)菌株脂肪酶基因序列，應(yīng)用Primer Prem ier 6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，為了便于亞克隆，在上下游引物的兩端分別設(shè)計(jì)一個(gè)EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，并在5＇端加入保護(hù)性堿基。上游引物:5＇-GGAATTC GTGCGTCGTCATTCATTT-3＇;下游引物:5＇-TAGCGGCCGCAATCTTATTTCCC-3＇。

LIP基因的體外擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積25μL:10 ×Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，上、下游引物各0.5μL，地衣芽孢桿菌 DNA 1μL，DNA Taq酶0.5μL，25mmol/L MgCl22μL，ddH2O 17.5μL;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性處理4m in;94℃變性30s，60℃退火30s;72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸3min。1.5%瓊脂糖膠電泳鑒定結(jié)果。

1.2.3 LIP基因的克隆 用DNA回收試劑盒切膠回收純化PCR產(chǎn)物，目的片段與pMD19-T載體4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于鋪有IPTG和X-gal的LB平板上，37℃倒置過(guò)夜。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落用LB液體增菌培養(yǎng)，小量抽提質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增鑒定。

1.2.4 LIP基因測(cè)序及分析 LIP基因序列測(cè)定由上海Invitrogen公司進(jìn)行。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNASTAR 7.10軟件分析并與GenBank已發(fā)表的基因進(jìn)行核酸序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌體形態(tài)及菌落形態(tài) 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落上積累較多黏液，牢固地附著在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后期呈裂葉狀，邊緣毛發(fā)狀(見(jiàn)圖1)，培養(yǎng)3d后菌落呈褶皺壘起的山丘狀。在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)形成白色菌膜，能兼性厭氧生長(zhǎng)。該菌革蘭氏染色為陽(yáng)性(見(jiàn)圖2)，菌體為桿狀，菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生芽孢，可判定為芽孢桿菌。孢囊無(wú)膨大，無(wú)伴孢晶體，能運(yùn)動(dòng)。

圖1 菌株BL03在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonymorphology of strain BL03 on nutrient agar plate

圖2 顯微鏡下菌株BL03菌體形態(tài)Fig.2 Morphlogy of strain BL03 undermicroscope

2.1.2 生理生化鑒定結(jié)果 用全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)-VITEK 32對(duì)菌株BL03進(jìn)行鑒定，主要生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及儀器分析結(jié)果，初步鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniform is)。

2.2 基因的PCR擴(kuò)增

以Bacillus licheniformis染色體DNA為模板，按前述方法對(duì)其脂肪酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出一條大小約625bp的DNA片段(圖3)，結(jié)果與預(yù)期大小相符。

2.3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

擴(kuò)增培養(yǎng)白色菌落，小量抽提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳鑒定。結(jié)果顯示得到了大約625bp的DNA片段(圖4)，表明LIP/pMD19-T克隆體系構(gòu)建成功。

2.4 序列測(cè)定及分析

測(cè)序結(jié)果表明LIP基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?15bp，編碼204個(gè)氨基酸。用DNAStar軟件預(yù)測(cè)氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)，結(jié)果如下:LIP分子質(zhì)量單位為21791.8u，理論等電點(diǎn)為9.32，堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)百分比為8.3%，酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)百分比為5.9%。包含有編碼脂肪酶的蛋白活性中心“G-x-S-x-x-G”的核酸序列，菌株BL03的脂肪酶基因核酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列如圖5。

表1 BL03菌株主要生理生化特征Table1 Themajor physiological and biochemical characteristics of strain BL03

圖3 LIP基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretogram analysis of LIP gene PCR product

圖4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant plasmids

菌株BL03的LIP基因與地衣芽孢桿菌ATCC 14580株LIP基因(GeneID:3098655)對(duì)比，核酸序列相似性達(dá)99.67%，推導(dǎo)理論氨基酸序列相似性為99.02%。與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens FZB42G)的 LIP基因的核酸序列相似性僅為67.97%，推導(dǎo)理論氨基酸序列相似性為65.7%。與萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)和短小芽孢桿菌(B.pum ilus)的基因序列進(jìn)化樹(shù)分析如圖6。

3 結(jié)論

圖5 菌株BL03的脂肪酶基因核酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.5 LIP gene sequence and putative amino acid sequence of BL03 strain

圖6 幾株芽孢桿菌的脂肪酶基因序列進(jìn)化樹(shù)分析圖Fig.6 phylogenetic tree of lipase gene sequence analysis from some Bacillus

從自然界篩選出的天然菌株產(chǎn)酶能力一般不高，而通過(guò)基因重組技術(shù)將天然菌株中的目標(biāo)基因克隆并構(gòu)建工程菌株，實(shí)現(xiàn)較高的產(chǎn)酶能力，是獲得工業(yè)微生物菌種的重要途徑。天然菌株的分離鑒定及目標(biāo)基因的克隆是構(gòu)建基因工程菌株的基礎(chǔ)，自2004年公布地衣芽孢桿菌模式菌株(ATCC 14580)的基因組序列以來(lái)，對(duì)于地衣芽孢桿菌基因的研究有較多的報(bào)道，然而對(duì)于地衣芽孢桿菌基因的認(rèn)識(shí)還比較有限，其基因的克隆也有限。因此從地衣芽孢桿菌中克隆出功能基因，開(kāi)發(fā)出穩(wěn)定性好、活力強(qiáng)、產(chǎn)量高的工程菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，具有十分重要的實(shí)用價(jià)值。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的一株芽孢桿菌從形態(tài)和生理生化特征初步鑒定為，地衣芽孢桿菌，根據(jù)在GenBank已經(jīng)發(fā)表的地衣芽孢桿菌LIP基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR體外擴(kuò)增該片段，測(cè)序表明，獲取了LIP基因完整的開(kāi)放閱讀框，該段序列與已發(fā)布的地衣芽孢桿菌脂肪酶基因(GeneID:3098655)相比，核酸序列相似為99.67%，僅有2個(gè)堿基的差異。為了便于定向亞克隆，在該基因上下游引物上分別設(shè)計(jì)了EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，LIP基因的獲取為后續(xù)研究該基因功能、工程菌株構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

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