鄭傳進(jìn)，吳小勇，*，楊 洋，曾祥珊

(1.廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東中山528458; 2.廣州市來利洪餅業(yè)有限公司，廣東廣州510470)

硒是人體必需的微量元素之一，存在于所有細(xì)胞、組織及器官中。硒在人體發(fā)揮抗氧化、增強(qiáng)免疫能力等多種重要的生物學(xué)功能［1-2］。缺硒將導(dǎo)致人體罹患多種疾病，包括癌癥、心血管病、肝病、哮喘、白內(nèi)障、胰臟疾病、糖尿病、生殖系統(tǒng)疾病、兒童發(fā)育不良等。越來越多的證據(jù)表明，改善硒的攝入狀況，對居民長遠(yuǎn)的健康有益，特別是可以降低居民罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)［3］。上世紀(jì)90年代初，在我國進(jìn)行的基于臨床的流行病學(xué)研究結(jié)果也表明，每天補(bǔ)充50～200μg的硒，可以降低肝癌及食道癌的風(fēng)險(xiǎn)［3］。因此，適當(dāng)?shù)奈a(bǔ)充對于維護(hù)人體健康是非常重要的。人體內(nèi)的硒主要是有機(jī)態(tài)硒，無機(jī)態(tài)硒對人體有一定的毒副作用;因此，補(bǔ)硒首選有機(jī)硒。利用生物本身對無機(jī)硒的富集和轉(zhuǎn)化能力，將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，是制備有機(jī)硒產(chǎn)品有效途徑，如利用含無機(jī)硒培養(yǎng)基發(fā)酵灰樹花，培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母或食用菌等途徑實(shí)現(xiàn)硒的轉(zhuǎn)化和富集［4-6］。有研究表明，大豆硒蛋白能顯著增強(qiáng)小鼠抗疲勞能力［7］，增加小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活力、促進(jìn)免疫器官發(fā)育、抑制腫瘤生長，且無任何毒副作用［8］，是一種品質(zhì)優(yōu)良的硒補(bǔ)充劑。本研究以亞硒酸鈉為硒源，以大豆為富硒載體，通過浸泡和萌發(fā)過程，實(shí)現(xiàn)大豆對硒元素的富集和生物轉(zhuǎn)化，制備得到富硒大豆;然后通過堿提酸沉工藝從富硒大豆中分離出富硒大豆蛋白。本文的研究結(jié)果將為富硒大豆及大豆硒蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北大豆 購于市場，選擇顆粒飽滿、無蟲蛀、無霉?fàn)€者進(jìn)行實(shí)驗(yàn);亞硒酸鈉 先導(dǎo)(清遠(yuǎn))稀有金屬有限公司產(chǎn)品，純度大于99%;硒標(biāo)準(zhǔn) 光譜純，A Johnson matthey company產(chǎn)品;其他化學(xué)試劑 均為分析純。

FA2004N型電子天平 上海精科;AFS-920雙道原子熒光光度計(jì) 北京吉天儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆富硒工藝流程 參照文獻(xiàn)［9］，對大豆進(jìn)行富硒處理:大豆→沖洗→浸泡→萌發(fā)

1.2.2 浸泡溫度對富硒大豆萌發(fā)和生長的影響 取5份重100g的大豆，沖洗干凈后分別置于500m L燒杯中，用300m L濃度為30μg/m L的亞硒酸鈉溶液浸泡，恒溫培養(yǎng)箱控制浸泡環(huán)境溫度分別為20、25、30、35、40℃，浸泡時(shí)間均為7h;浸泡后取出，瀝干水分，稱重，根據(jù)浸泡前后重量的差別，計(jì)算出各自的吸水率;然后將浸泡好的大豆置于25℃的恒溫、高濕環(huán)境(恒溫水浴箱)中萌發(fā)24h;再分別計(jì)算出各樣品的萌發(fā)率和芽長;比較浸泡溫度對大豆吸水率、萌芽率及芽長的影響，以確定對大豆富硒作用最有利的浸泡溫度。

1.2.3 浸泡時(shí)間對富硒大豆萌發(fā)和生長的影響 操作方法同1.2.2，固定浸泡溫度(30℃)和浸泡液中亞硒酸鈉的濃度(30μg/m L)，改變浸泡時(shí)間(分別為5、6、7、8、9h)，通過比較經(jīng)過處理后的大豆之吸水率、萌芽率、芽長，確定大豆富硒的最佳浸泡時(shí)間。

1.2.4 亞硒酸鈉濃度對富硒大豆萌發(fā)和生長的影響

操作方法同1.2.2，固定浸泡溫度(30℃)和浸泡時(shí)間(8h)，改變浸泡液中亞硒酸鈉的濃度(分別為20、30、40、50、60μg/m L)，通過比較大豆吸水率、萌芽率、芽長，確定大豆富硒的最佳亞硒酸鈉溶液濃度。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，以富硒大豆的蛋白硒含量為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，對大豆的富硒工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 大豆吸水率、萌發(fā)率、芽長的測定 大豆經(jīng)過浸泡后取出，瀝干水分稱重，浸泡前后大豆重量的差別，即為大豆的吸水量，大豆吸水量與原料大豆重量的比值即為大豆的吸水率(%)。

萌發(fā)率是指經(jīng)過浸泡、萌發(fā)處理后，樣品中萌發(fā)的大豆數(shù)量占樣品中大豆總數(shù)的百分比。萌發(fā)率的測定方法為，從每份萌發(fā)好的大豆樣品中隨機(jī)取出3份小樣，每份小樣的大豆總數(shù)在30～50粒之間，計(jì)數(shù)每份小樣中萌發(fā)與不萌發(fā)的大豆數(shù)，即可計(jì)算該份小樣的萌發(fā)率，然后用3份小樣萌發(fā)率的平均值來代表整份大豆樣品的萌發(fā)率。大豆是否萌發(fā)的判定標(biāo)準(zhǔn)為伸出大豆種皮的胚根長度大于1mm。

芽長的測定為，從每份萌發(fā)好的大豆樣品中隨機(jī)取出3份小樣，每份小樣的大豆總數(shù)在10～20粒之間，用直尺量出小樣中每粒大豆伸出種皮的胚根的長度(小于1mm的計(jì)為0)，全部長度之和除以大豆的粒數(shù)，即為這份小樣的芽長，然后用3份小樣芽長的平均值來代表整份大豆樣品的芽長。

1.2.7 富硒大豆總硒含量的測定 參照國標(biāo)GB/T 5009.93-2003食品中硒的測定［10］，采用氫化物原子熒光光譜法。

1.2.8 富硒大豆蛋白的制備 采用堿提酸沉工藝提取蛋白質(zhì)，通過透析的方法除去無機(jī)鹽。具體操作如下:稱取一定量的富硒大豆，加10倍蒸餾水勻漿，用4%的NaOH溶液將勻漿調(diào)至pH10，攪拌20min，然后4000r/min離心10m in，取上清液，用1mol/L的HCl溶液調(diào)至pH4.6，然后4000 r/m in離心10m in，取沉淀，用蒸餾水分散，再裝入截留分子量為3500的透析袋中，置于4～6℃蒸餾水中透析24h，其間每6h換一次蒸餾水，以除去可能殘留于蛋白質(zhì)中的硒鹽及其他無機(jī)鹽，然后取出透析袋內(nèi)沉淀，冷凍干燥，即制得富硒大豆蛋白。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸泡溫度對富硒大豆萌發(fā)和生長的影響

種子的吸水主要是吸脹吸水。吸脹吸水與溫度有關(guān)，在一定溫度范圍內(nèi)，種子吸脹吸水能力隨溫度升高而增強(qiáng)，即在一定的時(shí)間內(nèi)，種子的吸水率隨溫度升高而升高。浸泡溫度對大豆吸水率的影響見表1。結(jié)果表明，在20～35℃這一溫度范圍內(nèi)，大豆的吸水率隨溫度升高而升高;但當(dāng)浸泡溫度為40℃時(shí)，吸水率反而比30和35℃時(shí)低，說明浸泡溫度過高對大豆種子的吸水有負(fù)面影響。

浸泡溫度過高也不利于種子的萌發(fā)和生長，表1中的數(shù)據(jù)表明，在20～30℃這一溫度范圍內(nèi)，大豆的萌發(fā)率和芽長隨溫度升高而升高;但當(dāng)浸泡溫度超過30℃后，大豆的萌發(fā)率和芽長逐漸下降。萌發(fā)率和芽長是衡量大豆生長，進(jìn)而衡量其富硒能力的關(guān)鍵指標(biāo)。從本研究的結(jié)果來看，在30℃時(shí)，富硒大豆的吸水率為129.43%，與35℃時(shí)的吸水率相差不大，而萌發(fā)率為84.29%，芽長為1.19cm，均比其他溫度要高;因此，可以確定，在本研究中大豆富硒的最佳浸泡溫度為30℃。

表1 浸泡溫度對富硒大豆吸水率、萌發(fā)率及芽長的影響Table1 Relationship between soaking temperature and water absorption，germination rate，sprout length of selenium enriched soybean

2.2 浸泡時(shí)間對富硒大豆萌發(fā)和生長的影響

在溫度一定，其他條件相同時(shí)，大豆在浸泡過程中對水及水中亞硒酸鈉的吸收主要取決于浸泡時(shí)間。本文研究了不同的浸泡時(shí)間對大豆富硒作用的影響，結(jié)果見表2。由表2可以看出，當(dāng)浸泡時(shí)間在8h以內(nèi)時(shí)，富硒大豆的吸水率、萌發(fā)率、芽長均隨浸泡時(shí)間的延長而升高;但當(dāng)浸泡時(shí)間超過8h以后，除吸水率略有升高外，萌發(fā)率、芽長量反而有所下降;因此，可以確定最佳的浸泡時(shí)間為8h。

2.3 亞硒酸鈉濃度對富硒大豆萌發(fā)和生長的影響

亞硒酸鈉是一種無機(jī)硒鹽，若在浸泡液中的濃度太高，則會(huì)對大豆種子有一定的毒副作用，影響其吸水和萌發(fā)，不利于大豆的富硒作用。在確定了大豆富硒作用的最佳浸泡溫度、浸泡時(shí)間后，本文進(jìn)一步研究了浸泡液中亞硒酸鈉濃度對大豆富硒作用的影響，結(jié)果見表3。從表3可以看出，在20～60μg/m L的濃度范圍內(nèi)，除芽長外，富硒大豆的吸水率、萌發(fā)率都隨亞硒酸鈉濃度的升高而升高，且生長狀況均比較好，說明浸泡液中亞硒酸鈉的濃度還可以進(jìn)一步升高。

表2 浸泡時(shí)間對富硒大豆吸水率、萌發(fā)率及芽長的影響Table2 Relationship between soaking time and water absorption，germination rate，sprout length of selenium enriched soybean

為探索大豆種子能夠耐受的亞硒酸鈉濃度的范圍，本研究進(jìn)一步采用濃度分別為50、100、150、200、250μg/m L的亞硒酸鈉溶液浸泡大豆，進(jìn)行大豆富硒實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當(dāng)浸泡液中亞硒酸鈉濃度大于100μg/m L時(shí)，大豆的萌發(fā)和生長明顯受到抑制，但濃度在50～100μg/m L范圍內(nèi)時(shí)，大豆的吸水和萌發(fā)都還比較好，因此決定采用正交實(shí)驗(yàn)來確定亞硒酸鈉最佳濃度。

表3 亞硒酸鈉濃度對富硒大豆吸水率、萌發(fā)率、芽長的影響Table3 Relationship between Na2 SeO3 concentration and water absorption，germination rate，sprout length of selenium enriched soybean

表4 亞硒酸鈉濃度對富硒大豆吸水率、萌發(fā)率及芽長的影響Table4 Relationship between Na2 SeO3 concentration and water absorption，germination rate，sprout length of selenium enriched soybean

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

浸泡是大豆富硒過程的第一步，通過浸泡，大豆種子充分吸水，其中的營養(yǎng)物質(zhì)由凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變成溶膠態(tài)，為種子萌發(fā)過程中必需的各生物化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生創(chuàng)造條件;此外，在吸水的同時(shí)，浸泡液中的亞硒酸鈉會(huì)通過各種途徑進(jìn)入大豆中，與大豆中的成分形成物理或化學(xué)結(jié)合。萌發(fā)是大豆富硒過程的第二步，萌發(fā)過程中有大量的生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，包括大分子物質(zhì)的分解和合成。萌發(fā)階段是無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的主要階段。根據(jù)前期研究所掌握的信息，作者選擇萌發(fā)溫度、萌發(fā)時(shí)間、浸泡液亞硒酸鈉濃度這三個(gè)因素及各自相應(yīng)的水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以大豆蛋白硒含量為主要指標(biāo)，對萌發(fā)條件進(jìn)行優(yōu)化，直觀分析結(jié)果見表5，由表5可知，影響富硒大豆蛋白硒含量的因素主次順序?yàn)镃＞B＞A，即亞硒酸鈉濃度＞萌發(fā)時(shí)間＞萌發(fā)溫度，富硒工藝條件理論最佳實(shí)驗(yàn)組合為A2B2C3，方差分析結(jié)果(表6)表明，在考察的3種因素中，亞硒酸鈉的濃度對富硒大豆中蛋白硒含量影響達(dá)顯著水平，而萌發(fā)溫度和萌發(fā)時(shí)間對富硒水平影響不大。綜合分析結(jié)果和實(shí)際最佳實(shí)驗(yàn)組合(同理論最佳)，得出大豆富硒的最佳工藝為:亞硒酸鈉濃度80μg/m L，萌發(fā)時(shí)間36h，萌發(fā)溫度25℃，在此條件下，得到的富硒大豆其蛋白的硒含量高達(dá)31.95μg/g。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of orthogonal test

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table6 Variance analysis of orthogonal experimental result

3 結(jié)論

大豆種子發(fā)芽過程具有較強(qiáng)的富硒能力［11］。浸泡是種子發(fā)芽過程的重要一環(huán)，通過浸泡，大豆種子在吸水的同時(shí)，會(huì)吸收溶解在水中的亞硒酸鈉。種子的萌發(fā)過程有大量的物質(zhì)分解和合成，是種子中的硒由無機(jī)態(tài)轉(zhuǎn)變成有機(jī)態(tài)的關(guān)鍵階段。浸泡和萌發(fā)條件的控制對大豆的富硒能力有較大的影響。吸水率是衡量種子浸泡程度的主要指標(biāo)，萌發(fā)率和芽長是衡量種子萌發(fā)狀況的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究以吸水率、萌發(fā)率、芽長為主要指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)初步確定了大豆浸泡的最佳溫度、時(shí)間及亞硒酸鈉濃度;然后以富硒大豆硒蛋白含量為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)對大豆的富硒工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到大豆富硒的最佳工藝條件為:浸泡溫度30℃，浸泡時(shí)間8h，浸泡液中亞硒酸鈉濃度80μg/m L，萌發(fā)溫度25℃，萌發(fā)時(shí)間36h;并制備得到總硒含量為27.31μg/g的富硒大豆，及硒含量高達(dá)31.95μg/g的富硒大豆蛋白。況沖等以黃豆芽為富硒載體，制備出富硒黃豆芽并分離出富硒量為21.23μg/g的富硒大豆蛋白［12］。本研究制備得到的富硒大豆蛋白的硒含量，高于上述文獻(xiàn)報(bào)道。本文的研究結(jié)果將為富硒大豆及富硒大豆蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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