馬 飛，許 璞，朱建一，萬 能，湯 俊，*

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210046; 2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500)

地木耳(Nostoc commune)俗稱地皮菜，在世界各地廣泛分布，是少有的幾種可供人類食用的藍(lán)藻之一，中國、日本、菲律賓等國人民都有食用的習(xí)慣［1-2］。地木耳營養(yǎng)豐富，粗脂肪含量為 0.2% ～4.28%［3］，具有一定的醫(yī)療和保健價值［4-5］，并有地木耳營養(yǎng)保健飲料問世，具有很高的商業(yè)價值［6］。脂類物質(zhì)在植物細(xì)胞中具有重要的生物學(xué)功能，是膜脂的重要組分，其不飽和度影響生物膜的流動性，在藻類等對抗環(huán)境脅迫維持自身生存中起重要作用［7-9］。本實(shí)驗(yàn)研究氮源的有無對地木耳脂肪酸組成和含量的影響，以期為優(yōu)化培養(yǎng)條件和食品開發(fā)提供重要的科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地木耳藻種 中國科學(xué)院水生生物研究所典型培養(yǎng)物保藏委員會藻種庫。藻體接種于無氮培養(yǎng)基(BG110)中活化，然后取對數(shù)生長期的藻體進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。溫度為(27±2)℃，光照強(qiáng)度為60μE/(m2·s)，光暗周期為16∶8(h∶h)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置無氮培養(yǎng)基和含氮培養(yǎng)基(BG11)兩組。BG11培養(yǎng)基配方參照Rippka［10］的方法，BG110為不含NaNO3的BG11培養(yǎng)基;C19∶0脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品 色譜純，美國Alletch公司;三氯甲烷、甲醇、正己烷、NaOH、HCl均為色譜純。

GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 配有AOC20i自動進(jìn)樣器，日本島津公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 地木耳中脂肪酸的測定方法

1.2.1.1 總脂肪酸的提取［11］按改進(jìn)的Bligh-Dyer (mBD)法進(jìn)行，即在0.2g藻粉中加入8m L混合溶劑(氯仿∶甲醇∶蒸餾水=1∶2∶0.8)勻漿，加入40μg C19∶0脂肪酸內(nèi)標(biāo)，超聲5m in，離心，收集提取上層液。下層沉淀重復(fù)上述操作，共提取3次。合并所有的提取液，加入等體積的氯仿和蒸餾水(1∶1)混合，使其終濃度為氯仿∶甲醇∶蒸餾水=1∶1∶0.9，混勻靜置(加入適量5%NaCl)。上層為水相，含鹽類和水溶性物質(zhì)。下層為氯仿層，氯仿層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，獲得總脂肪酸。

1.2.1.2 脂肪酸的皂化和酯化［12］在獲得的總脂肪酸中加入1m L 1.5%(w/v)NaOH/CH3OH溶液，于55℃水浴保溫15min，再加入2m L 5%(v/v)HCl/ CH3OH溶液，于55℃水浴繼續(xù)保溫20m in。取2m L正己烷加入上述反應(yīng)體系內(nèi)混勻，靜置分層，吸出上層正己烷相，再向下層水相中加入2m L正己烷，重復(fù)上述步驟，合并三次吸出液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)蒸干，2m L正己烷定容，使脂肪酸甲酯(FAMEs)溶解，低溫保藏待分析。

1.2.1.3 分析條件 GC條件:采用RTX-Wax毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度220℃，載氣為99.999%的高純氦氣，進(jìn)樣時間1m in，柱流速1.00m L/m in，柱起始溫度60℃，保持2m in，以15℃/m in升溫至120℃，然后以2.5℃/m in升溫至220℃，保持15m in。采用分流進(jìn)樣，分流比為50∶1，進(jìn)樣量為1μL。

MS條件:電子轟擊(electron impact，EI)源能量70eV，溫度200℃，接口溫度220℃，選取全程離子碎片掃描(SCAN)模式，質(zhì)量掃描范圍為45～450m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù)，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算脂肪酸含量(mg/g)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸甲酯總離子流圖及組分鑒定

無氮培養(yǎng)和加氮培養(yǎng)的地木耳的脂肪酸甲酯成分總離子流圖(圖1、圖2)顯示，各脂肪酸組分按出峰順序依次為C16∶0、C16∶1、C16∶2、C18∶1、C18∶0、C18∶2、C18∶3，所有組分在保留時間55.0m in內(nèi)均達(dá)到基線分離。內(nèi)標(biāo)C19∶0出峰時間在39.5m in。根據(jù)GC-MS總離子流圖中各組分的離子碎片質(zhì)量譜圖，通過NIST05及NIST05s譜圖庫檢索，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜圖確認(rèn)其成分，同時采用內(nèi)標(biāo)法測得各組分含量(mg/g)，結(jié)果如表1所示。

表1 地木耳主要脂肪酸組成Table1 Themain fatty acids compositions of Nostoc commune

圖2 BG11培養(yǎng)的地木耳脂肪酸甲酯總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of fatty acid methyl esters from Nostoc commune cultivated in BG11

2.2 氮元素對地木耳總脂肪酸含量的影響

由圖3可以看出，無氮培養(yǎng)地木耳總脂肪酸含量為13.29mg/g，比含氮培養(yǎng)地木耳總脂肪酸含量的7.72mg/g高57%。

圖3 氮元素對地木耳總脂肪酸的影響Fig.3 Effect of nitrogen on the total amount of fatty acids of Nostoc commune

2.3 氮元素對地木耳飽和脂肪酸含量的影響

如圖4所示，無氮培養(yǎng)地木耳的總飽和脂肪酸的含量為 4.91mg/g，含氮培養(yǎng)的地木耳含量為3.70mg/g。無氮組總飽和脂肪酸含量比含氮組高32.7%。其中無氮培養(yǎng)和含氮培養(yǎng)地木耳的棕櫚酸(C16∶0)含量分別為4.60、2.77mg/g。

2.4 氮元素對地木耳不飽和脂肪酸含量的影響

如圖5所示，無氮培養(yǎng)地木耳的總不飽和脂肪酸含量為8.38mg/g，總單不飽和脂肪酸的含量為4.75mg/g，總多不飽和脂肪酸的含量為3.63mg/g;含氮培養(yǎng)的地木耳總不飽和脂肪酸含量為4.02mg/g，總單不飽和脂肪酸的含量為2.07mg/g，總多不飽和脂肪酸的含量為1.95mg/g，無氮培養(yǎng)地木耳總不飽和脂肪酸含量比含氮組高108.37%。

圖4 氮元素對地木耳總飽和脂肪酸的影響Fig.4 Effect of nitrogen on the total amount of saturated fatty acids of Nostoc commune

圖5 氮元素對地木耳不飽和脂肪酸的影響Fig.5 Effect of nitrogen on the total amount of unsaturated fatty acids of Nostoc commune

3 結(jié)果與討論

3.1 地木耳脂肪酸組成

本文研究了無氮培養(yǎng)和含氮培養(yǎng)地木耳的脂肪酸組成及含量，結(jié)果顯示，C16∶0、C16∶1、C16∶2、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3是地木耳脂肪酸主要組分。以C16∶0為主的飽和脂肪酸的比例在40%左右，以C16∶1以及C18不飽和脂肪酸為主的不飽和脂肪酸的比例在50%以上。Liu等的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)、灰念珠藻(Nostoc muscorum)、橢孢念珠藻(Nostoc ellipsosporun)脂肪酸以C16和C18為主要組分，飽和脂肪酸在30%左右，不飽和脂肪酸在60%左右［13］。Rezanka等的結(jié)果顯示，林氏念珠藻(Nostoc linckia)脂肪酸以C16～C18為主要組分，飽和脂肪酸在30%左右，不飽和脂肪酸在50%左右［14］。Gugger等的結(jié)果顯示，點(diǎn)形念珠藻(Nostoc punctiforme)脂肪酸以C16和C18為主要組分，飽和脂肪酸在20%左右，不飽和脂肪酸在70%左右［15］。以上研究結(jié)果表明不同念珠藻種類之間，脂肪酸含量和比例有一定差異，但均顯示了以C16～C18為主要脂肪酸組成，不飽和脂肪酸含量較高這一組成特點(diǎn)。

3.2 氮源缺少有利于脂肪酸的積累

脂肪酸的含量隨著環(huán)境條件的變化有明顯的變化，光照、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等都有可能影響其合成［16-18］。氮是藻類生長繁殖必需的營養(yǎng)元素，是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等的主要組成元素，而且其種類和含量對藻類的脂類組成有著關(guān)鍵性的影響［19-20］。Colla等證明，培養(yǎng)基中氮源濃度的下降引起鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)脂肪酸含量的上升［21］。Tedesco等的研究證明，氮源缺少引起鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)總脂肪酸含量升高［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，無氮培養(yǎng)地木耳總脂肪酸含量為13.29mg/g，含氮培養(yǎng)組含量為7.72mg/g，無氮組含量比含氮組高57.30%，表明氮源(NO)的缺失有利于地木耳脂肪酸的合成和積累。

3.3 不飽和脂肪酸的積累有利于地木耳逆境條件下生存

對干燥的發(fā)菜進(jìn)行不同時長復(fù)水，研究其膜脂的變化，發(fā)現(xiàn)磷脂酰甘油中C18∶1的含量隨著復(fù)水時間的延長而升高［23］。藻類處于鹽脅迫條件下，膜脂中的脂肪酸會發(fā)生去飽和化而提高膜脂脂肪酸的不飽和度，從而提高膜的流動性。膜流動性的提高能激活Na+/H+雙向運(yùn)輸系統(tǒng)來降低胞質(zhì)內(nèi)Na+的濃度，從而避免 NaCl對 PSⅡ、PSⅠ的失活作用［24-25］。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中氮源的有無對地木耳不飽和脂肪酸及C18∶0的影響較大。無氮培養(yǎng)地木耳C18∶0含量為 0.31mg/g，占其總脂肪酸的比例為2.31%，而含氮培養(yǎng)組為0.92mg/g，占總脂肪酸的比例為11.98%，后者是前者的1.96倍;無氮培養(yǎng)地木耳C18∶1含量為2.12mg/g，占總脂肪酸的比例達(dá)到15.99%，而含氮培養(yǎng)組的含量為0.13mg/g，占總脂肪酸的比例僅為1.74%，前者含量是后者的15.30倍;無氮培養(yǎng)地木耳總不飽和脂肪酸含量為8.38mg/g，占其總脂肪酸的比例為63.09%，而含氮培養(yǎng)組總不飽和脂肪酸的含量為4.02mg/g，占總脂肪酸的比例為52.09%，前者是后者的1.08倍。無氮培養(yǎng)地木耳與含氮培養(yǎng)的相比，硬脂酸含量的下降伴隨著不飽和脂肪酸特別是油酸含量的升高。表明氮缺失條件下脂肪酸特別是不飽和脂肪酸的積累，對地木耳維持生存具有重要意義。

4 結(jié)論

地木耳脂肪酸以C16～C18碳鏈長度的脂肪酸為主，不飽和脂肪酸含量達(dá)到總脂肪酸的50%以上。無氮培養(yǎng)地木耳的脂肪酸含量顯著高于含氮培養(yǎng)組(p＜0.05)，表明氮源缺失有利于地木耳脂肪酸特別是不飽和脂肪酸的積累。本研究就氮源對脂肪酸的組成和含量影響進(jìn)行了測定分析，所得結(jié)論對地木耳的人工培養(yǎng)以及食品開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)意義。

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