原江鋒，王大紅，何靈美，閆國琦，張清安

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003; 2.山西芳靈貿(mào)易有限責(zé)任公司，山西太原030045; 3.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

食品的腐敗變質(zhì)主要由微生物引起［1］，食品防腐劑在延長(zhǎng)食品貯藏期、保證食品品質(zhì)的過程中具有非常重要的作用。傳統(tǒng)食品防腐劑是以化學(xué)合成品多見，由于化學(xué)合成的防腐劑涉及到安全性問題，許多國家已逐步禁止或限制使用。因此研究天然食品防腐劑已經(jīng)成為食品科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。伏牛山區(qū)中藥資源占河南省總數(shù)的76.9%，藥用植物的品種數(shù)量和儲(chǔ)存量均位于全國前列，是全國藥用植物主要產(chǎn)區(qū)之一，其中連翹年產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的40%。伏牛山區(qū)連翹果實(shí)中連翹苷和連翹酯苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)［2］;近年來的研究發(fā)現(xiàn)連翹葉中有效成分如連翹苷、連翹脂苷、蘆丁等的含量高于果實(shí)［3-4］。由于連翹葉沒有進(jìn)入國家藥典，因此連翹葉資源尚未得到足夠的開發(fā)利用，造成大量的連翹葉片被遺棄，將連翹葉提取物作為天然防腐劑應(yīng)用在食品工業(yè)中，既可以提升連翹葉的價(jià)值，又可以為食品工業(yè)發(fā)掘新原料。本研究在伏牛山地區(qū)FSLE抗菌性能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究熱處理、pH、紫外線、氧化劑和金屬離子對(duì)連翹葉提取物(Forsythia Suspensa leaves extract，F(xiàn)SLE)抑菌穩(wěn)定性的影響，為伏牛山地區(qū)FSLE開發(fā)成安全可靠的食品天然防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

連翹葉采自河南省伏牛山地區(qū)，自然晾干，對(duì)其進(jìn)行研磨粉碎備用。銀杏葉提取物是河北天成藥業(yè)股份有限公司市售產(chǎn)品(總黃酮醇苷9.6mg/g，萜類內(nèi)酯2.4mg/g)。指示菌:細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌(Escherichia coli);真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus);以上菌種均由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。指示菌培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基［5］。

RE2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HK-02A手提式粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司; LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;BS210S分析天平 北京賽利斯天平有限公司;DL-5-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;202電熱恒溫干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠; YQDL201，YQDL204微量移液器 北京東林昌盛生物科技有限公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FSLE的制備 連翹葉以1∶10(w∶w)比例加蒸餾水，于80℃提取30m in后過濾，濾渣再重復(fù)煎煮兩次，合并3次濾液，濃縮干燥至浸膏，臨用前用不同條件處理后配成5%溶液濃度。

1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備［6］將所有供測(cè)試的細(xì)菌和真菌分別接種于牛肉膏蛋白胨和PDA固體斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，霉菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，連續(xù)傳代2次。將上述活化好的各種菌分別挑取一環(huán)制成初試菌懸液，取適量初試菌懸液用生理鹽水將其稀釋成含菌量為106～107CFU/m L的菌懸液備用。

1.2.3 FSLE抑菌性實(shí)驗(yàn)［7］將吸水性強(qiáng)的濾紙片用打孔器制成直徑為6mm的圓形濾紙片。將濾紙高壓滅菌后用無菌鑷子將濾紙片浸入無菌水、質(zhì)量濃度為5%無菌過濾的FSLE和銀杏葉提取物的溶液中30m in，烘干備用。分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或PDA表面加入0.2m L供試菌的菌懸液，用無菌涂布器涂布均勻，15min后用無菌鑷子夾取濾紙片貼于涂菌平板上。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24h，霉菌于28℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑大小，取其平均值(mm)為測(cè)定結(jié)果，每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。以上操作均在超凈工作臺(tái)上完成。

1.2.4 溫度對(duì)FSLE穩(wěn)定性的影響［8］將FSLE分別在80、100、121℃處理30min，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為5%的溶液，無菌過濾。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.2.3方法測(cè)定其抑菌活性。

1.2.5 pH對(duì) FSLE抗菌效果的影響［9］用1mol/L HCl和NaOH溶液把質(zhì)量濃度為5%FSLE調(diào)至pH4、5、6、7、8、9，無菌過濾，平衡24h后以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測(cè)定抑菌圈直徑大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 紫外照射對(duì)FSLE抑菌活性的影響［10］稱取若干份樣品，分別置于20W的紫外等下照射10、30、60、90、120m in，用蒸餾水配成5%的樣液，無菌過濾。同樣以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。

1.2.7 氧化劑對(duì)FSLE抑菌活性的影響 將FSLE配制成含3%H2O2的5%的樣液，無菌過濾后測(cè)定對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率。以未處理的樣品作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.8 金屬離子對(duì)FSLE穩(wěn)定性的研究［9］用1mol/L的不同金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+)溶液浸泡FSLE，將處理過的FSLE配制成5%的樣液，12h后測(cè)定其抑菌活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSLE的抑菌活性測(cè)定

由表1可知，F(xiàn)SLE對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是對(duì)大腸桿菌的抑制作用，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用較弱;而對(duì)根霉和黑曲霉無抑制作用。對(duì)不同的供試菌種的抑制效果在淡竹葉提取物中也有相同結(jié)果報(bào)道［11］。因此選取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為對(duì)FSLE的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的菌種。

表1 FSLE和銀杏葉提取物對(duì)常見菌的抑制效果Table1 Inhibitory effect of Forsythia Suspensa leaves extract and Ginkgo leaves extract on common bacteria strains

這一特點(diǎn)提示:FSLE添加于食品中對(duì)細(xì)菌類具有較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)真菌類的抑制還需要其它的防腐劑配合使用。由表1還可以看出，連翹葉提取物和陽性對(duì)照銀杏葉提取物的抑菌活性相比，F(xiàn)SLE具有較強(qiáng)的活性。

2.2 溫度對(duì)FSLE抑菌活性的影響

圖1 溫度對(duì)FSLE抑菌的影響Fig.1 The impact of temperature on the Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial

由圖1可知，隨溫度上升，其抑菌效果呈下降趨勢(shì)，說明溫度對(duì)FSLE的抑菌活性有一定的影響。但總體來說，F(xiàn)SLE在80～121°C范圍內(nèi)處理30min仍具有較強(qiáng)的抑菌效力，表明FSLE比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生熱變性，具備在食品中的使用要求。這與陳佳佳［12］得出桑葉提取物具備良好抗熱性的結(jié)論一致。這一熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)提示:FSLE即使添加于需進(jìn)行加熱處理的食品中，也可穩(wěn)定保持其抗菌防腐性能，可作為熱加工食品中的防腐劑。

2.3 pH對(duì)FSLE抑菌作用的影響

pH對(duì)FSLE抑菌作用的影響見圖2，在pH6時(shí)，F(xiàn)SLE抑菌效果達(dá)到最好，當(dāng)pH≤5或pH≥7時(shí)，隨著FSLE處理的pH逐漸降低或升高，F(xiàn)SLE的抑菌效果均會(huì)逐漸降低?？赡茉蚴?，pH升高或降低，改變了提取物有效抑菌成分結(jié)構(gòu);而在中性和弱酸的環(huán)境下FSLE的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的抑菌活性。這一特點(diǎn)提示，F(xiàn)SLE作為防腐劑添加在食品中，在中性和弱酸性環(huán)境中抑菌活性較強(qiáng)。

圖2 FSLE在不同pH下的抑菌活性Fig.2 The antibacterial activity of Forsythia Suspensa leaves extract at different pH

2.4 紫外線對(duì)FSLE抑菌作用的影響

紫外照射實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖3可知，F(xiàn)SLE經(jīng)不同時(shí)間的紫外照射后，在少于30m in對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制能力幾乎沒有影響，但是在30～120min范圍，F(xiàn)SLE的抑菌能力有所影響;而紫外線照射對(duì)FSLE對(duì)大腸桿菌的抑菌能力影響一直較大。由此看出對(duì)于不同菌種，F(xiàn)SLE的抑菌活性具有不同的紫外光穩(wěn)定性，推測(cè)原因?yàn)镕SLE對(duì)不同菌種的抑菌機(jī)制存在差異。這一特點(diǎn)提示，環(huán)境中的紫外線的存在和長(zhǎng)時(shí)間照射可能會(huì)影響到FSLE抑菌性能的發(fā)揮。

圖3 紫外照射對(duì)FSLE抑菌效果的影響Fig.3 Effect of ultraviolet on antibacterial activity of Forsythia Suspensa leaves extract

2.5 氧化劑對(duì)FSLE穩(wěn)定性的影響

由圖4可以看出，氧化劑H2O2對(duì)FSLE的穩(wěn)定性影響較大，可能原因是FSLE有效抑菌成分大多含不飽和雙鍵和其他可氧化基團(tuán)，使得氧對(duì)FSLE的有效抑菌成分造成破壞，從而導(dǎo)致其有效抑菌成分濃度的降低，所以FSLE應(yīng)密封保藏。這一特點(diǎn)提示: FSLE作為防腐劑，應(yīng)避免長(zhǎng)期與空氣接觸造成其抑菌效果的降低的問題。

圖4 氧化劑對(duì)連翹葉抑菌的影響Fig.4 Effect of oxidants on the Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial

2.6 金屬離子穩(wěn)定性的研究

由圖5可以看出，經(jīng)Na+、K+處理后，F(xiàn)SLE仍具有較強(qiáng)抑菌性能，但與未處理組相比，抑菌活性略有下降。而經(jīng)鈣、銅、鐵離子處理后其抑菌活性稍提高，其原因可能是重金屬及過渡金屬離子本身對(duì)菌體的生長(zhǎng)存在抑制作用。這一特點(diǎn)提示:FSLE作為防腐劑可以應(yīng)用在含有鈉、鉀、鈣、銅和鐵等金屬離子較豐富的食品中。

圖5 金屬離子對(duì)提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect ofmetal ions on antimicrobial activity of Forsythia Suspensa leaves extract

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)SLE對(duì)所試三種細(xì)菌具有比較好的抑制作用，而對(duì)所試真菌的抑制效果不明顯。植物中的提取物中如萜烯類、生物堿、類黃酮、甾類、酚類、獨(dú)特的氨基酸和多糖等都具有殺蟲和抗菌活性，本課題組下一步將進(jìn)行FSLE主要抑菌活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析研究，從而明確抑菌的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 FSLE的抑菌活性具有良好的熱穩(wěn)定性;在中性和弱酸性環(huán)境中FSLE抑菌活性較強(qiáng);在大于30m in紫外線照射對(duì)FSLE抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌活性有一定影響;對(duì)大腸桿菌的影響較大;應(yīng)盡量減少FSLE在空氣中的暴露時(shí)間;不同的金屬離子對(duì)FSLE抑菌性能影響不同，這些都是在實(shí)際應(yīng)用中需要切實(shí)考慮的問題。

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