劉一衡，楊 玲

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

新疆藥桑屬?？?，桑屬，黑桑種（Morus nigra Linn.），原產(chǎn)于伊朗，16世紀傳入我國，主要栽培于新疆南部的廣大地區(qū)[1]。新疆藥桑是我國唯一的黑桑種桑樹品種，也是自然界極為罕見的具有22倍體桑樹種質(zhì)資源[2]。桑葉中的生物堿是一類以1-脫氧野尻霉素（DNJ）為主的多羥基哌啶類化合物，DNJ具有與α-1，4-葡萄糖類似的結(jié)構(gòu)，擁有強烈的α-葡萄糖苷酶抑制活性和非常低的細胞毒性[3-4]，因此具有較好的降血糖作用，可用于治療糖尿病、肥胖癥等疾病[5]。

新疆藥桑在新疆南部干旱地區(qū)長期栽培過程中，為了適應(yīng)當(dāng)?shù)貥O端干旱少雨的自然環(huán)境，其形態(tài)特征、基因類型、生化及酶學(xué)特征等與其他桑種存在著顯著差異[6]。黑桑中生物活性成分的種類和含量也與其他產(chǎn)地的桑樹品種存在一定差異[7]。國內(nèi)外對桑屬植物的研究主要集中于桑（Morus alba L.），黑桑研究較少。因此，本實驗采用正交實驗設(shè)計，以新疆藥桑桑葉總生物堿含量為指標，對總生物堿的提取工藝進行優(yōu)化，旨在為新疆藥?？偵飰A的提取提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆藥桑桑葉 由當(dāng)?shù)鼐S醫(yī)和塔里木大學(xué)生命科學(xué)院楊玲老師鑒定；乙醇、硅鎢酸、鹽酸等 均為國產(chǎn)分析純。

FA1104電子分析天平 上海儀器天平廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FZ102植物粉碎機 上海銳豐儀器儀表有限公司；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

表1 L16（45）正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 將干燥的新疆藥桑桑葉在植物粉碎機上粉碎，制成藥桑桑葉干燥粉。根據(jù)實驗按需稱取10g藥桑桑葉干粉若干份，在提取溫度60℃，料液比1∶15，超聲波功率600W，乙醇濃度60%的基礎(chǔ)條件下分別設(shè)置不同提取時間（10、20、30、40、50、60min）、提取溫度（40、50、60、70、80、90℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）、超聲功率（300、400、500、600、700、800W）以及乙醇濃度（0%、20%、40%、60%、80%、100%），進行單因素實驗。

1.2.2 新疆藥桑桑葉生物堿待測液的制備 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以總生物堿含量為實驗指標，進行L16（45）正交實驗，正交實驗因素水平表見表1。

1.2.3 新疆藥桑桑葉總生物堿含量的檢測 采用硅鎢酸沉淀法[8]，將樣品待測液加鹽酸調(diào)至pH 2.0左右，逐滴加入10%硅鎢酸溶液至沉淀完全，靜置至溶液澄清，用定量濾紙（干燥至恒重）濾過，沉淀干燥至恒重，精密稱重。總生物堿按桑葉特征生物堿1-脫氧野尻霉素（分子式為C6H13NO4，分子量為163）計，總生物堿含量（mg·g-1）=沉淀重量（mg）/桑葉重量（g）×0.1856（理論換算因數(shù)=4R/SiO3·12WO3·4R·2H2O=0.1856）。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥桑桑葉總生物堿提取的單因素實驗

2.1.1 提取時間對總生物堿含量的影響 由圖1可知，總生物堿含量隨提取時間的增加而總體呈現(xiàn)增加的趨勢，可見提取時間越長總生物堿提取的越充分。但為了節(jié)約時間，選取20、30、40、50m in為正交實驗的四個水平。

圖1 提取時間對總生物堿含量的影響Fig.1 Effectof extraction time on the contentof total alkaloids

2.1.2 提取溫度對總生物堿含量的影響 由圖2可知，總生物堿含量隨溫度的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)溫度低于70℃時，總生物堿含量隨著溫度的升高而增加，這是因為隨著熱效應(yīng)的增加，分子運動加快，有利于總生物堿的溶出；當(dāng)溫度超過70℃時，部分生物堿高溫分解造成總生物堿含量隨溫度升高而下降。因此選擇50、60、70、80℃作為正交實驗中的四個水平。

圖2 提取溫度對總生物堿含量的影響Fig.2 Effectof extraction temperature on the contentof total alkaloids

2.1.3 料液比對總生物堿含量的影響 由圖3可知，當(dāng)料液比高于1∶15的時候，總生物堿含量隨料液比的降低而增加；當(dāng)料液比低于1∶15的時候總生物堿含量隨料液比的降低而降低。這是因為料液比高于1∶15時，隨著料液比增加，溶劑量增加，兩相間的濃度差增加，有利于總生物堿的擴散溶出；當(dāng)料液比低于1∶15的時候，總生物堿基本溶出，而溶劑增加會造成濃縮和過濾時的損失，從而導(dǎo)致總生物堿含量下降。因此，選取1∶10、1∶15、1∶20和1∶25四個水平進行正交實驗。

圖3 料液比對總生物堿含量的影響Fig.3 Effectof solid-liquid ratio on the contentof total alkaloids

2.1.4 超聲功率對總生物堿含量的影響 由圖4可見，總生物堿含量整體隨著超聲功率的增加而升高，這可能是因為隨著超聲功率的增加，超聲波的空化作用和剪切作用增加，有利于細胞壁的粉碎，從而使生物堿的溶出增加。因此選用500、600、700、800W作為正交實驗的四個水平。

圖4 超聲功率對總生物堿含量的影響Fig.4 Effectof ultrasonic power on the contentof total alkaloids

2.1.5 提取溶劑對總生物堿含量的影響 由圖5可見，在乙醇濃度低于60%時，總生物堿含量隨乙醇濃度增加而升高；而乙醇濃度高于60%時隨著乙醇濃度的增加總生物堿含量反而下降。乙醇濃度在40%～80%之間時，總生物堿含量較高，考慮到增加乙醇濃度會增加生產(chǎn)成本，所以選擇20%、40%、60%和80%作為正交實驗的四個水平。

圖5 乙醇濃度對總生物堿含量的影響Fig.5 Effectof ethanol volume fraction on the contentof total alkaloids

2.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果可知，提取時間、提取溫度、料液比、超聲功率以及乙醇濃度都會影響總生物堿的提取效果。為確定這5個因素的綜合影響，選取對總生物堿含量有意義的水平進行正交實驗，采用L16（45）正交實驗，實驗結(jié)果見表2。

由分析結(jié)果可知，各因素對總生物堿提取的影響主次順序為C＞E＞D＞B＞A，即料液比＞乙醇濃度＞超聲功率＞提取溫度＞提取時間。方差分析（表3）表明料液比對總生物堿提取有著極顯著意義，乙醇濃度對總生物堿提取有著顯著意義。因此優(yōu)選出來的最佳總生物堿提取組合為A1B2C3D4E3，即按料液比1∶20，以800W超聲功率在60℃用60%乙醇提取20m in。

2.3 驗證實驗

取新疆藥桑桑葉干粉三份，每份10g按優(yōu)選出來的最佳工藝進行提取，即按料液比1∶20，以800W超聲功率在60℃用60%乙醇提取20m in。按1.2.3的檢測方法進行檢測，按最佳工藝進行提取，總生物堿平均含量為4.64mg·g-1，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.73%，實驗結(jié)果高于正交實驗的其他組合，說明實驗結(jié)果是穩(wěn)定可行的。

表2 L16（45）正交實驗及其結(jié)果Table2 Results of L16（45）orthogonal test

表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal test results

3 結(jié)論與討論

目前桑葉中水溶性生物堿主要采用乙醇溶劑提取法、水或酸水提取法和親脂性有機溶劑提取法等[9]。水或酸水提取法雖能夠提取大部分的生物堿，但水溶性雜質(zhì)過多，如果需要進一步分離純化總生物堿，其水提液仍需加入乙醇沉淀除去桑葉多糖類物質(zhì)的干擾[10]。親脂性有機溶劑提取法僅能夠提取親脂性生物堿，并且能夠帶來親脂性雜質(zhì)。乙醇溶劑提取法是目前桑葉總生物堿提取的主要方法，但其工藝比較復(fù)雜，而超聲波處理利用超聲空化作用和微擾效應(yīng)，能夠有效地使植物細胞壁破裂，使細胞更容易釋放內(nèi)容物，并促進溶劑進入提取物細胞，加速成分進入溶劑，可大大縮短萃取時間和提高萃取率[11]，因此本實驗采用超聲波輔助的乙醇溶劑提取法提取桑葉總生物堿。

桑葉中總生物堿的含量測定方法主要有：重量沉淀法[12]、紫外分光光度法[13]、高效液相色譜法（HPLC）[14]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[15]等。紫外分光光度法所需的蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器等雖然靈敏度高結(jié)果較準確可靠，但其價格昂貴，不利于大面積應(yīng)用普及[16]。何軍等[17]比較了紫外分光光度法和重量沉淀法在測定附子總生物堿含量中的差異，發(fā)現(xiàn)重量沉淀法準確性、穩(wěn)定性要優(yōu)于紫外分光光度法。因此，本實驗采用經(jīng)典的重量沉淀法，具有不需要使用昂貴的對照品（如DNJ）、操作簡單、快捷等優(yōu)點。為排除非生物堿成分（多糖、多肽、蛋白質(zhì)等）對本檢測方法準確性的影響，將濃縮的樣品液加入90%乙醇，結(jié)果未見多糖結(jié)晶析出。并且供試液在3h內(nèi)穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，可作為新疆藥桑桑葉總生物堿含量測定的方法。

本實驗采用正交實驗優(yōu)化新疆藥桑桑葉總生物堿的最佳提取工藝，在最佳實驗條件：提取時間20m in，提取溫度60℃，料液比1∶20，超聲功率800W，乙醇濃度60%，得到總生物堿含量為4.64mg·g-1。結(jié)果表明利用超聲波輔助的乙醇溶劑提取法提取新疆藥桑桑葉總生物堿具有省時、高效、節(jié)能的優(yōu)點。

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