■ 宋春蓮 李文貴 尹革芬 譚麗勤 王艷芬 李 箐 劉 潔 舒相華

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南蒙自縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南蒙自 661100；3.云南普洱市思茅區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南普洱 66500；4.云南呈貢縣洛龍街道辦事處，云南呈貢 650500)

豬偽狂犬病毒(Pseudorabies，PR)、豬瘟病毒(Classical swine fever，CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV-2)是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病病原。他們?cè)谪i場(chǎng)呈不同形式的混合感染，使豬場(chǎng)疫病更加復(fù)雜，引起豬群呼吸道和繁殖障礙等疾病，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，這些病的廣泛流行和蔓延已給國(guó)內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成很大的損失。要對(duì)這些疫病進(jìn)行有效防控，首先要能準(zhǔn)確而快速的病原檢測(cè)，PCR檢測(cè)方法具有較高的實(shí)用價(jià)值。為了跟蹤云南地區(qū)豬CSF、PCV-2、PRRS、PR的流行病情況和規(guī)律，為研究預(yù)防這些病提供保障，對(duì)云南地區(qū)部分豬群2008～2011年送檢的這四種疫病進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料與方法

1.1 組織病料

病料采自云南昆明、曲靖、保山、玉溪、紅河、曲靖、楚雄、大理、臨滄、文山等地區(qū)291個(gè)豬場(chǎng)，4年共計(jì)979份。

1.2 試劑及儀器

病毒核酸DNA/RNA抽提試劑盒購(gòu)自Invitro?gen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、2xGC buffer購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL 2 000、2xPCR Mix購(gòu)自TaKaRas公司。根據(jù)國(guó)內(nèi)外發(fā)表的PRRSV、PCV-2、CSFV和PRV毒株序列，用DNASTAR.Lasergene.v7.1、Prim?er Premier 5、Oligo6等分子生物學(xué)分析軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。主要儀器由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程中心提供，PTC-150MiniCy?clerTMPCR儀（MJ Reseach）。

1.3 組織中總DNA、RNA的提取

采集的組織反復(fù)凍融3次，然后4℃條件下12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，混均，室溫放置10 min，然后4℃條件下12 000 r/min離心15 min；按病毒核酸DNA/RNA抽提試劑盒操作說(shuō)明提取核酸樣品，于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒核酸多重PCR擴(kuò)增

取上述抽提的核酸樣品12 μl，按操作說(shuō)明加入相應(yīng)試劑，按各種病毒核酸PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。

各反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小基本一致的片段則判定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 4年979份病料中CSF、PCV-2、PRRS和PR，4種病病原檢測(cè)結(jié)果。

各年度CSF、PR、PRRS、PCV-2的檢測(cè)結(jié)果：2008年檢測(cè) 216份，陽(yáng)性率分別為 20.83%、25.00%、46.30%、48.61%；2009年檢測(cè)57份，陽(yáng)性率分別為40.35%、63.16%、87.72%、49.12%；2010年檢測(cè) 174份，陽(yáng)性率分別為42.53%、43.10%、51.72%、56.89%。2011年檢測(cè)數(shù)532份，陽(yáng)性率分別為16.35%、15.04%、37.78%、25.00%(見(jiàn)表1)。

表1 2008～2011年4種病檢測(cè)情況

2.2 979個(gè)樣品中檢出率最高的是PRRSV，平均檢出率為55.88%，其次是PCV-2，平均檢出率為44.91%，CSFV和PRV的平均檢出率分別為20.02%、36.57%(見(jiàn)表 1)。

2.3 4年共對(duì)291個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)戶進(jìn)行了CSF、PCV-2、PRRS、PR的病原學(xué)檢測(cè)，每個(gè)場(chǎng)都有四種病感染，其中檢測(cè)出混合感染的場(chǎng)戶有111個(gè)。感染形式有二重、三重感染，另有少量的四重感染。二重感染以CSF+PRRS最多，占15.24%，其次是PR+PRRS，占13.27%，CSF+PR占13.20%，CSF+PCV-2占10.32%；三重感染以CSF+PR+PRRS最多，占8.08%，其次是CSF+PR+PCV-2，占6.26%，PR+PRRS+PCV-2占5.58%，PR+PRRS+PCV-2占4.12%；四重感染以2008年混合感染最多，占4.63%，四年平均發(fā)病率2.98%(見(jiàn)表2、表3)。

表2 二重感染情況

表3 三重和四重感染情況

2.4 CSF、PCV-2、PRRS和PR 4種病2008～2011年4年的平均陽(yáng)性率分別為30.02%、36.57%、55.88%、44.91%。單獨(dú)感染占35.24%（348/979）；二重感染占 64.76%（634/979）；三重感染占 21.55%（211/979）；四重感染占2.66%（26/979）。

3 分析與討論

3.1 檢測(cè)結(jié)果顯示，云南地區(qū)部分豬場(chǎng)發(fā)病豬只中PRRS檢出率最高，與舒相華等2007年的檢測(cè)結(jié)果相似，說(shuō)明在云南地區(qū)豬群中PRRS一直是主要的致死疫病，與李吉達(dá)等報(bào)道國(guó)內(nèi)其他地區(qū)發(fā)病情況相似。

3.2 這四種病的年度發(fā)病率差別很大。2008年P(guān)CV-2感染最為嚴(yán)重，2009年P(guān)RRS感染最為嚴(yán)重，2010年P(guān)CV-2感染最為嚴(yán)重，2011年P(guān)RRS感染最為嚴(yán)重。各疫病各年度發(fā)病率相差大，這表明這4種疫病在云南地區(qū)部分豬群中的感染比較嚴(yán)重，發(fā)生和流行規(guī)律變化最大，2008～2010年有逐年加重的趨勢(shì)，2011年又下降，與宋建國(guó)等報(bào)道的甘肅省發(fā)病情況相似。他們以混合感染為主，占64.45%，高于舒相華，李維華等的報(bào)道，其中最主要的是二重感染CSF+PRRS，跟李吉達(dá)、舒相華等的報(bào)道相似。三重感染以CSF+PR+PRRS為主，應(yīng)引起廣大養(yǎng)殖場(chǎng)戶和動(dòng)物防疫部門的高度重視。

3.3 在這些發(fā)病豬場(chǎng)中，肥豬以呼吸道疾病癥狀感染形式為最多，種豬群以繁殖障礙為主，這可能是由于這4種疫病既是免疫抑制性疾病，又是繁殖障礙性疾病的原因，從檢測(cè)結(jié)果看在云南要預(yù)防這些疫病的暴發(fā)，豬場(chǎng)必須重視他們的預(yù)防和監(jiān)測(cè)，有條件的豬場(chǎng)要做好種公豬或整個(gè)種豬群CSF、PCV-2、PRRS、PR的凈化工作，減少豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失。

（參考文獻(xiàn)15篇，刊略，需者可函索）