■張名愛(ài) 李潔慧 于翠芳 杜中彩

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109)

隨著近年來(lái)我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高以及乳制品（尤其是牛乳）需求量的增加，對(duì)牛乳及其乳制品的質(zhì)量要求也越來(lái)越高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2010年，我國(guó)人均奶類食品攝入量達(dá)到16 kg，比2000年增加一倍以上，由此看出中國(guó)的乳制品消費(fèi)市場(chǎng)潛力巨大[1]。隨著微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了許多關(guān)于菌落總數(shù)測(cè)定的新技術(shù)、新儀器、新方法和新標(biāo)準(zhǔn)。

菌落總數(shù)用于判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，是鮮牛奶重要的質(zhì)量控制指標(biāo)之一（鮮牛奶中細(xì)菌數(shù)要求低于2×105個(gè)/ml[2]），在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣，它反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出恰當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)[3]。本次試驗(yàn)對(duì)常規(guī)檢驗(yàn)的3種方法進(jìn)行比較研究，以期獲得理想的并能適應(yīng)不同具體情況的檢驗(yàn)方法，為食品質(zhì)量檢驗(yàn)部門和乳品企業(yè)中菌落總數(shù)的檢測(cè)提供參考，并為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的修改提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

原料乳：購(gòu)自農(nóng)場(chǎng)。

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、KH2PO4、NaOH及其他藥品均為國(guó)產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PYX-DHS-40×50-13-Ⅱ隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：龍口市先科儀器公司生產(chǎn)；HPS-250生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；HW.SY21-K電熱恒溫水浴鍋：龍口市電爐制造廠生產(chǎn)；YXQG02型電熱式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)；PHS-3C精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠生產(chǎn)；TB-214電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；電子調(diào)溫萬(wàn)用爐：龍口市先科儀器公司生產(chǎn)；DGX-9243B-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：廣東銀港科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檢驗(yàn)程序

檢樣→10倍系列稀釋→3個(gè)適宜樣品液，各1 ml加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)→每皿加入15～20 ml培養(yǎng)基，混勻→倒置培養(yǎng)→計(jì)數(shù)。

1.2.2 三種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法比較[4-7]

表1 三種標(biāo)準(zhǔn)的主要區(qū)別

1.2.3 測(cè)定

①原料乳的稀釋

取4個(gè)不同批次的原料乳，分別編號(hào)為S1、S2、S3、S4。取25 ml原料乳樣品于225 ml稀釋液中，充分混勻，制成10-1的樣品液。取10-1樣品液1 ml，沿管壁緩慢注于9 ml稀釋液中，混合均勻，制成10-2的樣品液，并依次制成10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度的樣品液。從制備最初的稀釋液至傾倒培養(yǎng)基時(shí)間間隔不宜超過(guò)15 min。

②接種培養(yǎng)

分別取10-3、10-4、10-5稀釋度的樣品液1 ml，傾注接種。每個(gè)梯度每種培養(yǎng)基做2個(gè)平板，同時(shí)做空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，倒置培養(yǎng)。

③計(jì)數(shù)

選取無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板用于計(jì)數(shù)。培養(yǎng)后每24 h計(jì)數(shù)，連續(xù)72 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 平皿計(jì)數(shù)結(jié)果

根據(jù)三種標(biāo)準(zhǔn)菌落總數(shù)測(cè)定方法對(duì)4個(gè)批次原料乳細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 平皿計(jì)數(shù)結(jié)果

由表2結(jié)果看出，培養(yǎng)基和稀釋液等條件相同，培養(yǎng)溫度不同時(shí)，F(xiàn)DA BAM-2001的檢測(cè)結(jié)果普遍高于GB/T 4789.2—2010；培養(yǎng)相同時(shí)間，菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果的總體情況為：IDF 100A：1987＜GB/T 4789.2—2010＜FDA BAM—2001；由此可知，35 ℃更適合原料乳中細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，檢出率更高。

2.2 三種方法測(cè)定結(jié)果的比較

菌落計(jì)數(shù)報(bào)告及三種方法之間的比較見(jiàn)表3。

表3 菌落總數(shù)

對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行比較分析，IDF 100A：1987檢出率顯著高于GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001方法，IDF 100A：1987檢出率為GB/T 4789.2—2010的2.2倍左右，F(xiàn)DA BAM—2001檢出率大約為GB/T 4789.2—2010檢出率的1.5倍左右。

2.3 差異顯著性分析

對(duì)三種檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方差分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，4種樣品間F=0.33＜1，即P＞0.05，樣品間無(wú)顯著差異，說(shuō)明該測(cè)定結(jié)果適用于不同樣品的檢測(cè)；三種方法間F=2.09＞F0.05，即P＜0.05，三種方法測(cè)定結(jié)果存在顯著差異，即IDF 100A：1987＞FDA BAM—2001＞GB/T 4789.2—2010。

2.4 測(cè)定結(jié)果分析

對(duì)表2、表3、表4測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，IDF 100A：1987檢出率最高，營(yíng)養(yǎng)全面，菌落易于分辨，缺點(diǎn)是檢驗(yàn)周期長(zhǎng)；FDA BAM—2001優(yōu)于GB/T 4789.2—2010，其共同優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，檢驗(yàn)周期短。檢驗(yàn)方法中影響檢驗(yàn)結(jié)果的主要因素包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、計(jì)數(shù)方法等。

2.4.1 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成為細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供了必需的碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水等營(yíng)養(yǎng)元素。GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001使用的培養(yǎng)基均為平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基，與世界乳品聯(lián)合會(huì)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)IDF 100A：1987使用的IDF培養(yǎng)基相比，IDF 100A：1987培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)更全面，利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，對(duì)檢出率的提高起了主要作用，而且其培養(yǎng)基顏色淺，易于計(jì)數(shù)，流動(dòng)性好，容易與樣品稀釋液混勻。說(shuō)明在菌落計(jì)數(shù)中，IDF培養(yǎng)基要優(yōu)于平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基。

2.4.2 培養(yǎng)溫度

由于各種食品中所分布的細(xì)菌種類不同，其最佳檢測(cè)溫度也不盡相同[8]。實(shí)驗(yàn)采用的三種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中使用的培養(yǎng)溫度分別為37、30、35℃。其中，GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的主要區(qū)別在于計(jì)數(shù)范圍和培養(yǎng)溫度，由表2結(jié)果表明，35℃條件下菌落總數(shù)的檢出率高于37℃，35℃更適于原料乳中細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.4.3 培養(yǎng)時(shí)間

從培養(yǎng)周期看，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，同類別微生物生長(zhǎng)繁殖的代數(shù)越多，數(shù)量也就越多。GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的培養(yǎng)周期短為48 h，而IDF 100A：1987為72 h，這可能也是表3結(jié)果中IDF 100A：1987檢出率高于GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的原因。但培養(yǎng)周期太長(zhǎng)，不利于快速、大批量的檢測(cè)。

2.4.4 稀釋液

培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)細(xì)菌增長(zhǎng)有一定影響，GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001采用的稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液或生理鹽水，IDF 100A：1987采用蛋白胨溶液。蛋白胨溶液中含有較多有利于細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且對(duì)食品中已受損的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用[9]，而且檢樣稀釋至傾注平板在15 min內(nèi)完成，時(shí)間較短，對(duì)菌落檢出率的影響可忽略不計(jì)。因此在制備樣品稀釋液時(shí)，采用蛋白胨溶液要比磷酸鹽緩沖液或生理鹽水更能提高菌落總數(shù)的檢出率。

2.4.5 計(jì)數(shù)范圍

計(jì)數(shù)范圍的選擇在很大程度上也會(huì)影響檢出率。理論上講，計(jì)數(shù)范圍越小，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏小。三種檢測(cè)方法的計(jì)數(shù)范圍分別為：GB/T 4789.2—2010 30～300 CFU，IDF 100A：1987 10～300 CFU，F(xiàn)DA BAM—2001 25～250 CFU。試驗(yàn)結(jié)果顯示，IDF 100A：1987的檢測(cè)結(jié)果最大，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。

3 小結(jié)

原料乳中菌落總數(shù)的測(cè)定方法有多種，而對(duì)于培養(yǎng)溫度的選擇應(yīng)選擇兼顧體溫型和室溫型兩類微生物，國(guó)外采用35℃是偏體溫型，采用30℃是偏室溫型，而國(guó)內(nèi)統(tǒng)一選擇37℃應(yīng)用于所有食品[10]，在一定程度上不利于微生物的檢出。通過(guò)對(duì)GB/T 4789.2—2010，IDF 100A：1987和FDA BAM—2001中規(guī)定的菌落總數(shù)測(cè)定方法進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，三種標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定結(jié)果間存在顯著性差異，其中，IDF 100A：1987方法中培養(yǎng)基成分的營(yíng)養(yǎng)全面，檢出率最高，但檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不利于快速檢測(cè)；在培養(yǎng)時(shí)間相同、培養(yǎng)基成分相同時(shí)，F(xiàn)DA BAM—2001的檢出率高于GB/T 4789.2—2010，說(shuō)明培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，更有利于原料乳中細(xì)菌的生長(zhǎng)，便于菌落總數(shù)的檢出；在原料乳的檢測(cè)上，GB/T 4789.2—2010的檢出率略低于IDF 100A：1987和FDA BAM—2001。